Vaccine and antiviral development against SARS-CoV-2 infection or COVID-19 disease would benefit from validated small animal models. Here, we show that transgenic mice expressing human angiotensin-converting enzyme 2 (hACE2) by the human cytokeratin 18 promoter (K18 hACE2) represent a susceptible rodent model. K18 hACE2 transgenic mice succumbed to SARS-CoV-2 infection by day 6, with virus detected in lung airway epithelium and brain. K18 ACE2 transgenic mice produced a modest TH1/2/17 cytokine storm in the lung and spleen that peaked by day 2, and an extended chemokine storm that was detected in both lungs and brain. This chemokine storm was also detected in the brain at day 6. K18 hACE2 transgenic mice are, therefore, highly susceptible to SARS-CoV-2 infection and represent a suitable animal model for the study of viral pathogenesis, and for identification and characterization of vaccines (prophylactic) and antivirals (therapeutics) for SARS-CoV-2 infection and associated severe COVID-19 disease.

Vaccines and drugs have helped reduce disease severity and blunt the spread of SARS-CoV-2. However, ongoing virus transmission, continuous evolution, and increasing selective pressures have the potential to yield viral variants capable of resisting these interventions. Here, we investigate the susceptibility of natural variants of the main protease (Mpro/3CLpro) of SARS-CoV-2 to protease inhibitors. Multiple single amino acid changes in Mpro confer resistance to nirmatrelvir (the active component of Paxlovid). An additional clinical-stage inhibitor, ensitrelvir (Xocova), shows a different resistance mutation profile. Importantly, phylogenetic analyses indicate that several of these resistant variants have pre-existed the introduction of these drugs into the human population and are capable of spreading. These results encourage the monitoring of resistance variants and the development of additional protease inhibitors and other antiviral drugs with different mechanisms of action and resistance profiles for combinatorial therapy.

SARS-CoV-2 variants of concern (VoCs) are impacting responses to the COVID-19 pandemic. Here we present a comparison of the SARS-CoV-2 USA-WA1/2020 (WA-1) strain with B.1.1.7 and B.1.351 VoCs and identify significant differences in viral propagation in vitro and pathogenicity in vivo using K18-hACE2 transgenic mice. Passive immunization with plasma from an early pandemic SARS-CoV-2 patient resulted in significant differences in the outcome of VoC-infected mice. WA-1-infected mice were protected by plasma, B.1.1.7-infected mice were partially protected, and B.1.351-infected mice were not protected. Serological correlates of disease were different between VoC-infected mice, with B.1.351 triggering significantly altered cytokine profiles than other strains. In this study, we defined infectivity and immune responses triggered by VoCs and observed that early 2020 SARS-CoV-2 human immune plasma was insufficient to protect against challenge with B.1.1.7 and B.1.351 in the mouse model.

We and others have previously shown that the SARS-CoV-2 accessory protein ORF6 is a powerful antagonist of the interferon (IFN) signaling pathway by directly interacting with Nup98-Rae1 at the nuclear pore complex (NPC) and disrupting bidirectional nucleo-cytoplasmic trafficking. In this study, we further assessed the role of ORF6 during infection using recombinant SARS-CoV-2 viruses carrying either a deletion or a well characterized M58R loss-of-function mutation in ORF6. We show that ORF6 plays a key role in the antagonism of IFN signaling and in viral pathogenesis by interfering with karyopherin(importin)-mediated nuclear import during SARS-CoV-2 infection both in vitro , and in the Syrian golden hamster model in vivo . In addition, we found that ORF6-Nup98 interaction also contributes to inhibition of cellular mRNA export during SARS-CoV-2 infection. As a result, ORF6 expression significantly remodels the host cell proteome upon infection. Importantly, we also unravel a previously unrecognized function of ORF6 in the modulation of viral protein expression, which is independent of its function at the nuclear pore. Lastly, we characterized the ORF6 D61L mutation that recently emerged in Omicron BA.2 and BA.4 and demonstrated that it is able to disrupt ORF6 protein functions at the NPC and to impair SARS-CoV-2 innate immune evasion strategies. Importantly, the now more abundant Omicron BA.5 lacks this loss-of-function polymorphism in ORF6. Altogether, our findings not only further highlight the key role of ORF6 in the antagonism of the antiviral innate immune response, but also emphasize the importance of studying the role of non-spike mutations to better understand the mechanisms governing differential pathogenicity and immune evasion strategies of SARS-CoV-2 and its evolving variants.SARS-CoV-2 ORF6 subverts bidirectional nucleo-cytoplasmic trafficking to inhibit host gene expression and contribute to viral pathogenesis.

Abstract SARS-CoV-2 infection results in viral burden in the upper and lower respiratory tract, enabling transmission and often leading to substantial lung pathology. Delivering the antiviral treatment directly to the lungs has the potential to improve lung bioavailability and dosing efficiency. As the SARS-CoV-2 Receptor Binding Domain (RBD) of the Spike (S) is increasingly deemed to be a clinically validated target, RBD-specific B cells were isolated from patients following SARS-CoV-2 infection to derive a panel of fully human monoclonal antibodies (hmAbs) that potently neutralize SARS-CoV-2. The most potent hmAb, 1212C2 was derived from an IgM memory B cell, has high affinity for SARS-CoV-2 RBD which enables its direct inhibition of RBD binding to ACE2. The 1212C2 hmAb exhibits in vivo prophylactic and therapeutic activity against SARS-CoV-2 in hamsters when delivered intraperitoneally, achieving a meaningful reduction in upper and lower respiratory viral burden and lung pathology. Furthermore, liquid nebulized inhale treatment of SARS-CoV-2 infected hamsters with as low as 0.6 mg/kg of inhaled dose, corresponding to approximately 0.03 mg/kg of lung deposited dose, mediated a reduction in respiratory viral burden that is below the detection limit, and mitigated lung pathology. The therapeutic efficacy achieved at an exceedingly low-dose of inhaled 1212C2 supports the rationale for local lung delivery and achieving dose-sparing benefits as compared to the conventional parenteral route of administration. Taken together, these results warrant an accelerated clinical development of 1212C2 hmAb formulated and delivered via inhalation for the prevention and treatment of SARS-CoV-2 infection.

ABSTRACT A series of SARS-CoV-2 variants of concern (VOCs) have evolved in humans during the COVID-19 pandemic—Alpha, Beta, Gamma, Delta, and Omicron. Here, we used global proteomic and genomic analyses during infection to understand the molecular responses driving VOC evolution. We discovered VOC-specific differences in viral RNA and protein expression levels, including for N, Orf6, and Orf9b, and pinpointed several viral mutations responsible. An analysis of the host response to VOC infection and comprehensive interrogation of altered virus-host protein-protein interactions revealed conserved and divergent regulation of biological pathways. For example, regulation of host translation was highly conserved, consistent with suppression of VOC replication in mice using the translation inhibitor plitidepsin. Conversely, modulation of the host inflammatory response was most divergent, where we found Alpha and Beta, but not Omicron BA.1, antagonized interferon stimulated genes (ISGs), a phenotype that correlated with differing levels of Orf6. Additionally, Delta more strongly upregulated proinflammatory genes compared to other VOCs. Systematic comparison of Omicron subvariants revealed BA.5 to have evolved enhanced ISG and proinflammatory gene suppression that similarly correlated with Orf6 expression, effects not seen in BA.4 due to a mutation that disrupts the Orf6-nuclear pore interaction. Our findings describe how VOCs have evolved to fine-tune viral protein expression and protein-protein interactions to evade both innate and adaptive immune responses, offering a likely explanation for increased transmission in humans. One sentence summary Systematic proteomic and genomic analyses of SARS-CoV-2 variants of concern reveal how variant-specific mutations alter viral gene expression, virus-host protein complexes, and the host response to infection with applications to therapy and future pandemic preparedness.

Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2 (SARS-CoV-2) marks the third novel β-coronavirus to cause significant human mortality in the last two decades. Although vaccines are available, too few have been administered worldwide to keep the virus in check and to prevent mutations leading to immune escape. To determine if antibodies could be identified with universal coronavirus activity, plasma from convalescent subjects was screened for IgG against a stabilized pre-fusion SARS-CoV-2 spike S2 domain, which is highly conserved between human β-coronavirus. From these subjects, several S2-specific human monoclonal antibodies (hmAbs) were developed that neutralized SARS-CoV-2 with recognition of all variants of concern (VoC) tested (Beta, Gamma, Delta, Epsilon, and Omicron). The hmAb 1249A8 emerged as the most potent and broad hmAb, able to recognize all human β-coronavirus and neutralize SARS-CoV and MERS-CoV. 1249A8 demonstrated significant prophylactic activity in K18 hACE2 mice infected with SARS-CoV-2 lineage A and lineage B Beta, and Omicron VoC. 1249A8 delivered as a single 4 mg/kg intranasal (i.n.) dose to hamsters 12 hours following infection with SARS-CoV-2 Delta protected them from weight loss, with therapeutic activity further enhanced when combined with 1213H7, an S1-specific neutralizing hmAb. As little as 2 mg/kg of 1249A8 i.n. dose 12 hours following infection with SARS-CoV Urbani strain, protected hamsters from weight loss and significantly reduced upper and lower respiratory viral burden. These results indicate in vivo cooperativity between S1 and S2 specific neutralizing hmAbs and that potent universal coronavirus neutralizing mAbs with therapeutic potential can be induced in humans and can guide universal coronavirus vaccine development.

Abstract SARS-CoV-2, the causative agent of the COVID-19 pandemic, drastically modifies infected cells in an effort to optimize virus replication. Included is the activation of the host p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway, which plays a major role in inflammation and is a central driver of COVID-19 clinical presentations. Inhibition of p38/MAPK activity in SARS-CoV-2-infected cells reduces both cytokine production and viral replication. Here, we combined genetic screening with quantitative phosphoproteomics to better understand interactions between the p38/MAPK pathway and SARS-CoV-2. We found that several components of the p38/MAPK pathway impacted SARS-CoV-2 replication and that p38β is a critical host factor for virus replication, and it prevents activation of the type-I interferon pathway. Quantitative phosphoproteomics uncovered several SARS-CoV-2 nucleocapsid phosphorylation sites near the N-terminus that were sensitive to p38 inhibition. Similar to p38β depletion, mutation of these nucleocapsid residues was associated with reduced virus replication and increased activation of type-I interferon signaling. Taken together, this study reveals a unique proviral function for p38β that is not shared with p38α and supports exploring p38β inhibitor development as a strategy towards developing a new class of COVID-19 therapies. Importance SARS-CoV-2 is the causative agent of the COVID-19 pandemic that has claimed millions of lives since its emergence in 2019. SARS-CoV-2 infection of human cells requires the activity of several cellular pathways for successful replication. One such pathway, the p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway, is required for virus replication and disease pathogenesis. Here, we applied systems biology approaches to understand how MAPK pathways benefit SARS-CoV-2 replication to inform the development of novel COVID-19 drug therapies.

An infectious coronavirus disease 2019 (COVID-19) emerged in the city of Wuhan (China) in December 2019, causing a pandemic that has dramatically impacted public health and socioeconomic activities worldwide. A previously unknown coronavirus, Severe Acute Respiratory Syndrome CoV-2 (SARS-CoV-2), has been identified as the causative agent of COVID-19. To date, there are no United States (US) Food and Drug Administration (FDA)-approved vaccines or therapeutics available for the prevention or treatment of SARS-CoV-2 infection and/or associated COVID-19 disease, which has triggered a large influx of scientific efforts to develop countermeasures to control SARS-CoV-2 spread. To contribute to these efforts, we have developed an infectious cDNA clone of the SARS-CoV-2 USA-WA1/2020 strain based on the use of a bacterial artificial chromosome (BAC). Recombinant (r)SARS-CoV-2 was readily rescued by transfection of the BAC into Vero E6 cells. Importantly, the BAC-derived rSARS-CoV-2 exhibited growth properties and plaque sizes in cultured cells comparable to those of the SARS-CoV-2 natural isolate. Likewise, rSARS-CoV-2 showed similar levels of replication to that of the natural isolate in nasal turbinates and lungs of infected golden Syrian hamsters. This is, to our knowledge, the first BAC based reverse genetics system for the generation of infectious rSARS-CoV-2 that displays similar features in vivo to that of a natural viral isolate. This SARS-CoV-2 BAC-based reverse genetics will facilitate studies addressing several important questions in the biology of SARS-CoV-2, as well as the identification of antivirals and development of vaccines for the treatment of SARS-CoV-2 infection and associated COVID-19 disease.

Targeting host factors exploited by multiple viruses could offer broad-spectrum solutions for pandemic preparedness. Seventeen candidates targeting diverse functions emerged in a screen of 4,413 compounds for SARS-CoV-2 inhibitors. We demonstrated that lapatinib and other approved inhibitors of the ErbB family receptor tyrosine kinases suppress replication of SARS-CoV-2, Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV), and other emerging viruses with a high barrier to resistance. Lapatinib suppressed SARS-CoV-2 entry and later stages of the viral life cycle and showed synergistic effect with the direct-acting antiviral nirmatrelvir. We discovered that ErbB1, 2 and 4 bind SARS-CoV-2 S1 protein and regulate viral and ACE2 internalization, and they are required for VEEV infection. In human lung organoids, lapatinib protected from SARS-CoV-2-induced activation of ErbB-regulated pathways implicated in non-infectious lung injury, pro-inflammatory cytokine production, and epithelial barrier injury. Lapatinib suppressed VEEV replication, cytokine production and disruption of the blood-brain barrier integrity in microfluidic-based human neurovascular units, and reduced mortality in a lethal infection murine model. We validated lapatinib-mediated inhibition of ErbB activity as an important mechanism of antiviral action. These findings reveal regulation of viral replication, inflammation, and tissue injury via ErbBs and establish a proof-of-principle for a repurposed, ErbB-targeted approach to combat emerging viruses.