RATIONALE Cathinone derivatives are new amphetamine-like stimulants that can evade detection when presently available methods are used for doping control. To prevent misuse of these banned substances in racehorses, development of a liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC/MS/MS) method became the impetus for undertaking this study. METHODS Analytes were recovered via liquid-liquid extraction using methyl tert-butyl ether. Analyte separation was achieved on a hydrophilic interaction column using liquid chromatography and mass analysis was performed on a QTRAP mass spectrometer in positive electrospray ionization (ESI) mode with multiple reaction monitoring (MRM). Analyte identification was carried out by screening for a specified MRM transition. Quantification was conducted using an internal standard. Confirmation was performed by establishing a match in retention time and ion intensity ratios comparison. RESULTS The method was linear over the range 0.2–50 ng/mL. The specificity was evaluated by analysis of six different batches of blank plasma and those spiked with each analyte (0.2 ng/mL). The recovery of analytes from plasma at three different concentrations was >70%. The limits of detection, quantification and confirmation were 0.02–0.05, 0.2–1.0 and 0.2–10 ng/mL, respectively. The matrix effect was insignificant. The intra-day and inter-day precision were 1.94–12.08 and 2.58–13.32%, respectively. CONCLUSIONS The method is routinely employed in screening for the eleven analytes in post-competition samples collected from racehorses in Pennsylvania to enforce the ban on the use of these performance-enhancing agents in racehorses. The method is sensitive, fast, effective and reliably reproducible. Copyright © 2013 John Wiley & Sons, Ltd.

SUMMARY Discovery of molecules in living systems and demonstration of their functional roles are pivotal in furthering our understanding of the molecular basis of biology. ppGpp (guanosine-5’-diphosphate, 3’-diphosphate) has been detected in prokaryotes for more than five decades. Here we report that a genetic screen followed by chemical analysis revealed the presence of ppGpp in Drosophila. It can be detected in germ-free Drosophila and its level is controlled by an enzyme encoded by the mesh1 gene in Drosophila. Loss of function mutations in mesh1 , which encoded the ppGpp degrading enzyme led to longer sleep latency and less total sleep. These phenotypes could be rescued by wild type mesh1 , but not by the enzymatically defective mutant Mesh1E66A, functionally implicating ppGpp. Ectopic expression of RelA, the E. coli synthetase for ppGpp, phenocopied mesh1 knockout mutants, whereas overexpression of mesh1 resulted in the opposite phenotypes, supporting that ppGpp is both necessary and sufficient in sleep regulation. mesh1 is expressed in a specific population of neurons, and a chemoconnectomic screen followed by genetic intersection experiments implicate the pars intercerebralis (PI) as the site of ppGpp function. Our results have thus revealed that ppGpp is present in animals after long lag since its discovery in bacteria. Furthermore, we have demonstrated that ppGpp in a specific subset of neurons plays a physiological role in regulating sleep. We speculate that ppGpp may play function in mammals.

ABSTRACT Sleep is essential for animals, and receives inputs from circadian, homeostasis, and environment, yet the mechanisms of sleep regulation remain elusive. Discovery of molecules in living systems and demonstration of their functional roles are pivotal in furthering our understanding of the molecular basis of biology. Here we report that ppGpp (guanosine-5’-diphosphate, 3’-diphosphate), a molecule that has been detected in prokaryotes for more than five decades, is present in Drosophila , and plays an important role in regulation of sleep and SISL (starvation induced sleep loss). ppGpp is detected in germ-free Drosophila and hydrolyzed by an enzyme encoded by the mesh1 gene in Drosophila . Nighttime sleep and SISL were defected in mesh1 mutant flies, and rescued by expression of wildtype Mesh1, but not the enzymatically defective mutant Mesh1E66A. Ectopic expression of RelA, the E. coli synthetase for ppGpp, phenocopied mesh1 knockout mutants, whereas overexpression of Mesh1 resulted in the opposite phenotypes, supporting that ppGpp is both necessary and sufficient in sleep regulation. A chemoconnectomic screen followed by genetic intersection experiments implicate the Dilp2 neurons in the pars intercerebralis (PI) brain region as the site of ppGpp function. Our results have thus supported that ppGpp is present in animals after long lag since its discovery in bacteria, and revealed a physiological role of ppGpp in sleep regulation for the first time.

Fluorine is a strong oxidizing element and excessive intake can have harmful effects, particularly on the body's calcified tissues. Recent studies have demonstrated a link between miRNA and fluorosis. This study aimed to evaluate the time-dose-effect relationship of miR-200c-3p in plasma, urine and cartilage of rats with drinking water fluorosis, and to explore its potential as a biomarker. Analyses were conducted using Generalised linear models, Restricted cubic spline, Spearman correlation analysis, and Receiver operating characteristic curve (ROC). Results indicated that both fluoride exposure time and dose had significantly affected on urinary and cartilage miR-200c-3p expression in rats, while plasma miR-200c-3p expression was only influenced by fluoride exposure time. Restricted cubic spline plots revealed that urinary miR-200c-3p was non-linearly and positively correlated with serum fluoride, urinary fluoride, dental fluorosis, and Mankin score groups, and also linearly and positively correlated with cartilage fluoride. Regression analysis showed that for each unit increase in urinary miR-200c-3p, the likelihood of dental fluorosis increased by 1.300 times, and in the Mankin score groups, the likelihood increased by 1.251 times. The ROC curves demonstrated that urinary miR-200c-3p had high sensitivity and specificity in diagnosing dental and skeletal fluorosis. Blood and cartilage miR-200c-3p showed weaker diagnostic efficacy. In summary, fluoride has different effects on the expression levels of miRNA-200c in various biological samples of rats, and miRNAs in urine demonstrate potential as biomarkers for fluorosis.