The interleukin-1 receptor (IL-1R) signaling pathway leads to nuclear factor kappa B (NF-kappaB) activation in mammals and is similar to the Toll pathway in Drosophila: the IL-1R-associated kinase (IRAK) is homologous to Pelle. Two additional proximal mediators were identified that are required for IL-1R-induced NF-kappaB activation: IRAK-2, a Pelle family member, and MyD88, a death domain-containing adapter molecule. Both associate with the IL-1R signaling complex. Dominant negative forms of either attenuate IL-1R-mediated NF-kappaB activation. Therefore, IRAK-2 and MyD88 may provide additional therapeutic targets for inhibiting IL-1-induced inflammation.

Members of the Toll-like receptor (TLR) family probably play a fundamental role in pathogen recognition and activation of innate immunity. The present study used a systematic approach to analyze how different human leukocyte populations express specific transcripts for the first five characterized TLR family members. TLR1 was expressed in all leukocytes examined, including monocytes, polymorphonuclear leukocytes, T and B cells, and NK cells. In contrast TLR2, TLR4, and TLR5 were expressed in myelomonocytic elements. Exposure to bacterial products, such as LPS or lipoarabinomannan, or to proinflammatory cytokines increased TLR4 expression in monocytes and polymorphonuclear leukocytes, whereas IL-10 blocked this effect. TLR3 was only expressed in human dendritic cells (DC) wherein maturation induced by bacterial products or cytokines was associated with reduced expression. TLR3 mRNA expression was detected by in situ hybridization in DC and lymph nodes. These results demonstrate that TLR1 through TLR5 mRNAs are differentially expressed and regulated in human leukocytes. In particular, expression of TLR3 transcripts is restricted to DC that are the only elements which express the full TLR repertoire. These data suggest that TLR can be classified based on expression pattern as ubiquitous (TLR1), restricted (TLR2, TLR4, and TLR5 in myelomonocytic cells), and specific (TLR3 in DC) molecules.

The assembly of the CD-95 (Fas/Apo-1) receptor death-inducing signaling complex occurs in a hierarchical manner; the death domain of CD-95 binds to the corresponding domain in the adapter molecule Fas-associated death domain (FADD) Mort-1, which in turn recruits the zymogen form of the death protease caspase-8 (FLICE/Mach-1) by a homophilic interaction involving the death effector domains. Immediately after recruitment, the single polypeptide FLICE zymogen is proteolytically processed to the active dimeric species composed of large and small catalytic subunits. Since all caspases cleave their substrates after Asp residues and are themselves processed from the single-chain zymogen to the two-chain active enzyme by cleavage at internal Asp residues, it follows that an upstream caspase can process a downstream zymogen. However, since FLICE represents the most apical caspase in the Fas pathway, its mode of activation has been enigmatic. We hypothesized that the FLICE zymogen possesses intrinsic enzymatic activity such that when approximated, it autoprocesses to the active protease. Support for this was provided by (i) the synthesis of chimeric Fpk3FLICE molecules that can be oligomerizedin vivo by the synthetic cell-permeable dimerizer FK1012H2. Cells transfected with Fpk3FLICE underwent apoptosis after exposure to FK1012H2; (ii) the creation of a nonprocessable zymogen form of FLICE that retained low but detectable protease activity. The assembly of the CD-95 (Fas/Apo-1) receptor death-inducing signaling complex occurs in a hierarchical manner; the death domain of CD-95 binds to the corresponding domain in the adapter molecule Fas-associated death domain (FADD) Mort-1, which in turn recruits the zymogen form of the death protease caspase-8 (FLICE/Mach-1) by a homophilic interaction involving the death effector domains. Immediately after recruitment, the single polypeptide FLICE zymogen is proteolytically processed to the active dimeric species composed of large and small catalytic subunits. Since all caspases cleave their substrates after Asp residues and are themselves processed from the single-chain zymogen to the two-chain active enzyme by cleavage at internal Asp residues, it follows that an upstream caspase can process a downstream zymogen. However, since FLICE represents the most apical caspase in the Fas pathway, its mode of activation has been enigmatic. We hypothesized that the FLICE zymogen possesses intrinsic enzymatic activity such that when approximated, it autoprocesses to the active protease. Support for this was provided by (i) the synthesis of chimeric Fpk3FLICE molecules that can be oligomerizedin vivo by the synthetic cell-permeable dimerizer FK1012H2. Cells transfected with Fpk3FLICE underwent apoptosis after exposure to FK1012H2; (ii) the creation of a nonprocessable zymogen form of FLICE that retained low but detectable protease activity. Apoptosis, or programmed cell death, is a cell deletion mechanism that is critical to metazoan survival (1Steller H. Science. 1995; 267: 1445-1449Crossref PubMed Scopus (2445) Google Scholar, 2Raff M.C. Nature. 1992; 356: 397-400Crossref PubMed Scopus (2507) Google Scholar). The cell death machinery is conserved throughout evolution and is composed of several distinct parts including effectors, inhibitors, and activators (1Steller H. Science. 1995; 267: 1445-1449Crossref PubMed Scopus (2445) Google Scholar, 3Chinnaiyan A. Dixit V. Curr. Biol. 1996; 6: 555-562Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar). Mammalian cysteine proteases (designated caspase for cysteine aspartic acid-specific protease) related to the Caenorhabditis elegans cell death gene CED-3 represent the effector components of the apoptotic machinery participating in a regulated proteolytic cascade (4Martin S. Green D. Cell. 1995; 82: 349-352Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1266) Google Scholar, 5Henkart P. Immunity. 1996; 4: 195-201Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (417) Google Scholar). Since all caspases cleave their substrates after Asp residues and are themselves processed from the single-chain zymogen to the two-chain active enzyme by cleavage at internal Asp residues, it follows that an upstream caspase can process a downstream zymogen (6Muzio M. Salvesen G.S. Dixit V.M. J. Biol. Chem. 1997; 272: 2952-2956Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (313) Google Scholar, 7Orth K. O'Rourke K. Salvesen G. Dixit V. J. Biol. Chem. 1996; 271: 20977-20980Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (187) Google Scholar, 8Srinivasula S. Ahmad M. Fernandes-Alnemri T. Litwack G. Alnemri E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 14486-14491Crossref PubMed Scopus (484) Google Scholar). The assembly of the Fas receptor death-inducing signaling complex occurs in a hierarchical manner; the death domain of CD-95 binds to the corresponding domain in the adapter molecule Fas-associated death domain (FADD) Mort-1, which in turn recruits the zymogen form of the death protease caspase-8 (FLICE/Mach-1) by a homophilic interaction involving the death effector domains (9Chinnaiyan A. O'Rourke K. Tewari M. Dixit V. Cell. 1995; 81: 505-512Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (2189) Google Scholar, 10Boldin M. Varfolomeev E. Pancer Z. Mett I. Camonis J. Wallach D. J. Biol. Chem. 1995; 270: 7795-7798Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (945) Google Scholar, 11Boldin M. Goncharov T. Goltsev Y. Wallach D. Cell. 1996; 85: 803-815Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2124) Google Scholar, 12Muzio M. Chinnaiyan A. Kischkel F. O'Rourke K. Shevchenko A. Ni J. Scaffidi C. Bretz J. Zhang M. Gentz R. Mann M. Krammer P. Peter M. Dixit V. Cell. 1996; 85: 817-827Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2760) Google Scholar). Immediately after recruitment, the single polypeptide FLICE zymogen is proteolytically processed to the active dimeric species composed of large and small catalytic subunits that amplify the apoptotic signal by activating other downstream caspases (6Muzio M. Salvesen G.S. Dixit V.M. J. Biol. Chem. 1997; 272: 2952-2956Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (313) Google Scholar, 8Srinivasula S. Ahmad M. Fernandes-Alnemri T. Litwack G. Alnemri E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 14486-14491Crossref PubMed Scopus (484) Google Scholar, 13Medema J. Scaffidi C. Kischkel F.C. Shevchenko A. Mann M. Krammer P.H. Peter M.E. EMBO J. 1997; 16: 2794-2804Crossref PubMed Scopus (1045) Google Scholar). However, since FLICE represents the most apical caspase in the Fas pathway, its mode of activation has been enigmatic. We hypothesized that the FLICE zymogen possesses intrinsic enzymatic activity such that when approximated, it autoprocesses to the active protease. Support for this model was provided by two independent approaches: (i) the synthesis of chimeric Fpk3FLICE molecules that can be oligomerized in vivo by the synthetic cell-permeable dimerizer FK1012H2. Cells transfected with Fpk3FLICE underwent apoptosis after exposure to FK1012H2; (ii) the creation of a nonprocessable zymogen form of FLICE that retained low but detectable protease activity. MFpk3Eu vector containing a myristoylation site, three copies of Fpk in tandem and a hemagglutinin epitope tag (HA) was originally made by D. Spencer (Baylor College of Medicine). Fpk is a double mutant of FKBP12 where residues 89 and 90 have been mutated from GI to PK (14Spencer D. Wandless T. Schreiber S. Crabtree G. Science. 1993; 262: 1019-1024Crossref PubMed Scopus (712) Google Scholar). The catalytic domain of FLICE (encoding Ser-217 to Asp-479) was obtained by polymerase chain reaction and sub-cloned in-frame between the last Fpk and the epitope tag at the SalI site in MFpk3Eu. The same catalytic domain of a mutant version of FLICE, in which Cys-360 was replaced by Ser, was similarly cloned. For production of recombinant purified proteins, the catalytic domain of FLICE or mutant versions of FLICE in which the catalytic Cys-360 was replaced by Ser and/or the cleavage sites Asp-374 and Asp-384 were replaced by Ala, were obtained by polymerase chain reaction and sub-cloned into the pET15b expression vector (Novagen). The proteins were expressed in the BL21 pLysS Escherichia coli strain and purified using the QIAexpress Kit (Qiagen) following the manufacturer's instructions. Human embryonic kidney 293 and HeLa cells were cultured as described previously. Cell death assays were performed as described (9Chinnaiyan A. O'Rourke K. Tewari M. Dixit V. Cell. 1995; 81: 505-512Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (2189) Google Scholar). Hela cells were transfected using the lipofectAMINE procedure (Life Technologies, Inc.) according to the manufacturer's instructions. 293 cells were transfected using calcium phosphate precipitation. For immunoblotting analysis, cells (5 × 105) were lysed in 50 μl of buffer (50 mm KCl, 50 mm HEPES, 5 mm EGTA, 2 mm MgCl2, protease inhibitor mixture) followed by three cycles of freeze thaw. The membrane-rich fraction was pelleted, resuspended in 8 murea and, after boiling in sample buffer, resolved by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, transferred to nitrocellulose membrane, and probed with anti-HA antibody. For coimmunoprecipitation analysis, cells (2 × 106) were lysed in 1 ml of buffer (1% Nonidet P-40, 150 mm NaCl, 50 mmTris, 20 mm HEPES, protease inhibitor mixture) and incubated either with anti-HA 1The abbreviations used are: HA, hemagglutinin; PIPES, 1,4-piperazinediethanesulfonic acid; CHAPS, 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid; BIO-DEVD-AMK, N-(biotinyl-Asp-Glu-Val-Asp-[(2,6-dimethylbenzoyl)oxy]methyl ketone; -CMK, chloromethyl ketone; -FMK, fluoromethyl ketone; -AFC, 7-amino-4-trifluoromethyl coumarin; Z-, carbobenoxy. antibodies or anti-FLICE (small subunit-specific) rabbit antiserum. Immune complexes were precipitated by the addition of protein G-Sepharose (Sigma). After extensive washing, the Sepharose beads were boiled in sample buffer, and the eluted proteins were analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting with anti-HA antibody. The enzymatic reaction was carried out at 37 °C in 20 mmPIPES, 0.1 mm substrate, 100 mm NaCl, 10 mm dithiothreitol (fresh), 1 mm EDTA, 0.1% CHAPS, and 10% sucrose, pH 7.2. The initial rates of hydrolysis were measured by release of AFC (7-amino-4-methyl cou marin) from the substrate by the enzymes at appropriate emission and excitation wavelengths using a Perkin-Elmer LS50B fluorimeter equipped with a thermostated plate reader. Titrations of wild type and FLICE-DD [arrow] AA were carried out by preincubating the enzyme with varying concentrations of Z-DEVD-FMK or CrmA in assay buffer for 30 min at room temperature. The inhibitor was added at concentrations spanning from 0 to significantly above the concentration of active enzyme. After the preincubation, Z-DEVD-AFC was added in assay buffer to a final substrate concentration of 0.1 mm. The relative amount of uninhibited enzyme was evaluated from the initial rates of hydrolysis of the substrate as described above, and the concentration of active enzyme was calculated by extrapolating data points to their intersection with the x axis. The caspase-8 concentration used in the titration assays were 0.2 micromolar for the native enzyme and 20 micromolar for the DD → AA mutant. 100 ng of purified proteins were incubated with or without N-(biotinyl-Asp-Glu-Val-Asp-[(2,6-dimethylbenzoyl)oxy]methyl ketone (BIO-DEVD-AMK) (15Clayton L. Ghendler Y. Mizoguchi E. Patch R. Ocain T. Orth K. Bhan A. Dixit V. Reinherz E. EMBO J. 1997; 16: 2282-2293Crossref PubMed Scopus (90) Google Scholar) at a concentration of 0.5 μm in a final volume of 50 μl of buffer (0.1% CHAPS, 10 mmdithiothreitol, 10 mm Tris, pH 7.5) for 15 min at 25 °C. For competition experiments, increasing amounts of a nonbiotinylated version of the DEVD tetrapeptide (DEVD-CMK; Bachem) were added to the reaction. Samples were boiled in sample buffer in the absence of reductant, resolved by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under nonreducing conditions, blotted onto nitrocellulose, blocked in phosphate-buffered saline containing 3% bovine serum albumin and 0.1% Tween 20, incubated with streptavidin-conjugated horseradish peroxidase (ICN) in phosphate-buffered saline, 0.1% bovine serum albumin, 0.1% Tween, washed with 50 mm Tris, pH 7.5, 0.25% gelatin, 0.05% Tween 20, 150 mm NaCl, 5 mm EDTA, and developed by ECL. Alternatively, the membrane was analyzed by immunoblotting with anti-FLICE antiserum specific for the small catalytic subunit. To determine if FLICE oligomerization in vivo could result in activation, chimeric FpkFLICE expression constructs were engineered. Fpk (molecular mass 12 kDa), a double mutant of FKBP (FK binding protein FK506) (16Yang D. Rosen M.K. Schreiber S.L. J. Am. Chem. Soc. 1993; 115: 819-820Crossref Scopus (104) Google Scholar) contains a single binding site for the cell-permeable immunosuppressive drug FK506. The FKBP-FK506 complex is a potent inhibitor of calcineurin, a protein phosphatase that plays a key role in signaling. An FK506 dimer (FK1012H2) was previously synthesized by introducing a cross-linker into the domain of FK506 necessary for inhibition of calcineurin. FK1012H2, although unable to bind calcineurin, still retains its ability to bind and dimerize Fpk polypeptides given its bivalent nature (17Hofmann K. Tschopp J. FEBS Lett. 1995; 371: 321Crossref PubMed Scopus (103) Google Scholar, 18Rothe M. Sarma V. Dixit V.M. Goeddel D.V. Science. 1995; 269: 1424-1427Crossref PubMed Scopus (988) Google Scholar, 19Heguy A. Baldari C. Macchia G. Telford J.L. Melli M. J. Biol. Chem. 1992; 267: 2605-2609Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) (Fig. 1 a). To mimic recruitment of FLICE to its receptor signaling complex (11Boldin M. Goncharov T. Goltsev Y. Wallach D. Cell. 1996; 85: 803-815Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2124) Google Scholar,12Muzio M. Chinnaiyan A. Kischkel F. O'Rourke K. Shevchenko A. Ni J. Scaffidi C. Bretz J. Zhang M. Gentz R. Mann M. Krammer P. Peter M. Dixit V. Cell. 1996; 85: 817-827Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2760) Google Scholar), the prodomain of FLICE was substituted with a myristoylation signal followed by three tandem repeats of Fpk,(MFpk3FLICE). A catalytically inactive version was constructed by mutating the active-site Cys-360 to Ser (MFpk3FLICE(C → S)). An additional control was the construct MFpk3Eu that encoded only the myristoylation signal, three Fpk repeats in tandem, and an HA epitope tag (Fig. 1 b). To confirm the ability of FK1012H2 to induce oligomerization of Fpk3-containing proteins, human 293 cells were transiently transfected with the MFpk3Eu construct and the catalytically inactive chimera MFpk3FLICE(C → S). The MFpk3FLICE immunoprecipitates contained associating MFpk3Eu only in the presence of FK1012H2 (Fig. 1 c), confirming the validity of the dimerization approach. Ectopic expression of the catalytically active chimera MFpk3FLICE resulted in the production of a protein of predicted molecular mass (69 kDa) that was membrane-associated. The addition of the synthetic ligand FK1012H2 induced rapid disappearance of the catalytically competent MFpk3FLICE chimera. Emergence of the active subunits, however, was not detectable under these experimental conditions. As predicted, the catalytically inactive derivative was efficiently expressed, but on exposure to FK1012H2, did not undergo processing even after prolonged incubation (Fig. 2 a). We next observed if MFpk3FLICE oligomerization resulted in the expected apoptotic demise of transfected cells. Human 293 and HeLa cells were transiently transfected with MFpk3FLICE(C → S) or MFpk3FLICE expression constructs together with a reporter plasmid encoding β-galactosidase. Thirty six h after transfection, cells were left untreated or treated with 250 nm FK1012H2, stained, and analyzed by phase contrast microscopy. As shown in Fig. 2 b, oligomerization of MFpk3FLICE but not MFpk3FLICE(C → S) induced phenotypic alterations characteristic of apoptosis. Cells shrank, displayed membrane blebbing, and detached from the dish. Additionally, the apoptotic substrate poly(ADP-ribose) polymerase was cleaved to its signature 85-kDa form, and genomic DNA was cleaved into characteristic internucleosomal size fragments (data not shown), both biochemical hallmarks of apoptosis. Significantly, treatment of Fpk or Fpk-FLICE(C → S)-transfected cells with higher doses of FK1012H2 for an extended period of time did not induce apoptosis (16Yang D. Rosen M.K. Schreiber S.L. J. Am. Chem. Soc. 1993; 115: 819-820Crossref Scopus (104) Google Scholar, 17Hofmann K. Tschopp J. FEBS Lett. 1995; 371: 321Crossref PubMed Scopus (103) Google Scholar, 19Heguy A. Baldari C. Macchia G. Telford J.L. Melli M. J. Biol. Chem. 1992; 267: 2605-2609Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 20Spencer D. Belshaw P. Chen L. Ho S. Randazzo F. Crabtree G. Schreiber S. Curr. Biol. 1996; 6: 839-847Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (124) Google Scholar) (data not shown). After 3 h of exposure to the synthetic ligand, 50–80% MFpk3FLICE-transfected cells started blebbing, condensing, and detaching from the dish. This was completely abrogated by the broad-spectrum caspase inhibitor Z-VAD-FMK that has previously been shown to inhibit FLICE-induced apoptosis (Fig. 2, c and d) (12Muzio M. Chinnaiyan A. Kischkel F. O'Rourke K. Shevchenko A. Ni J. Scaffidi C. Bretz J. Zhang M. Gentz R. Mann M. Krammer P. Peter M. Dixit V. Cell. 1996; 85: 817-827Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2760) Google Scholar). Importantly, the monomeric form of the ligand, FK506M, did not induce apoptosis, confirming that the results observed were oligomerization-dependent (Fig. 2, c and d). These data demonstrate that specific clustering of FLICE zymogen causes apoptosis through caspase activation. We hypothesized that this activation occurs through self-processing of the clustered FLICE due to an intrinsic proteolytic activity of the zymogen. To further address this hypothesis, different recombinant versions of FLICE were generated (Fig. 3 a); as shown previously (6Muzio M. Salvesen G.S. Dixit V.M. J. Biol. Chem. 1997; 272: 2952-2956Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (313) Google Scholar, 8Srinivasula S. Ahmad M. Fernandes-Alnemri T. Litwack G. Alnemri E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 14486-14491Crossref PubMed Scopus (484) Google Scholar, 11Boldin M. Goncharov T. Goltsev Y. Wallach D. Cell. 1996; 85: 803-815Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2124) Google Scholar), overexpression of catalytically competent FLICE constructs in E. coli generated an active heterodimeric enzyme composed of large and small catalytic subunits. Enzymatically inactive FLICE (catalytic Cys-360 mutated to Ser; FLICE(C → S)) did not undergo processing, consistent with a requirement for intrinsic enzymatic activity. Importantly, an altered form of FLICE that retained the catalytic cysteine but was mutated at the internal cleavage sites (Asp-374 and Asp-384; FLICE(DD → AA)) also did not undergo auto-processing and was expressed as a single polypeptide zymogen as confirmed by protein staining and anti-FLICE immunoblot analysis (data not shown and Fig. 3 c). The processing mutant FLICE in which the catalytic cysteine was additionally inactivated (FLICE (DDCAAS)) was also expressed as a single polypeptide zymogen. These recombinant forms of FLICE were used to establish whether the zymogen did indeed possess enzymatic activity. The activity of the cleavage site mutant version FLICE(DD → AA) was determined by its ability to hydrolyze the tetrapeptide caspase substrate Z-DEVD-AFC (21Nicholson D. All A. Thornberry N.A. Vaillancourt J.P. Ding C.K. Gallant M. Gareau Y. Griffin P.R. Labelle M. Lazebnik Y.A. Munday N.A. Raju S.M. Smulson M.E. Yamin T. Yu V.L. Miller D.K. Nature. 1995; 376: 37-43Crossref PubMed Scopus (3840) Google Scholar), and the portion of active material was determined by titration with the protein inhibitor CrmA (22Zhou Q. Snipas S. Orth K. Muzio M. Dixit V.M. Salvesen G.S. J. Biol. Chem. 1997; 272: 7797-7800Crossref PubMed Scopus (490) Google Scholar, 23Ray C. Black R.A. Kronheim S.R. Greenstreet T.A. Sleath P.R. Salvesen G.S. Pickup D.J. Cell. 1992; 69: 597-604Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (929) Google Scholar) and the covalent peptide based inhibitor, Z-DEVD-FMK (21Nicholson D. All A. Thornberry N.A. Vaillancourt J.P. Ding C.K. Gallant M. Gareau Y. Griffin P.R. Labelle M. Lazebnik Y.A. Munday N.A. Raju S.M. Smulson M.E. Yamin T. Yu V.L. Miller D.K. Nature. 1995; 376: 37-43Crossref PubMed Scopus (3840) Google Scholar). A 100-fold more FLICE(DD → AA) was required on a protein basis to give the same rates of substrate hydrolysis as wild type FLICE (Fig. 3 b). Thus, from these results it is apparent that the bacterially expressed FLICE(DD → AA) mutant equivalent to the zymogen form has approximately 1% of the activity of the wild type enzyme. As expected, the catalytic mutant FLICE(C → S) possessed no enzymatic activity (data not shown). To interpret the enzymatic analysis, we tested the ability of the different versions of FLICE to bind the biotinylated irreversible inhibitor BIO-DEVD-AMK, which covalently binds to the active-site cysteine (15Clayton L. Ghendler Y. Mizoguchi E. Patch R. Ocain T. Orth K. Bhan A. Dixit V. Reinherz E. EMBO J. 1997; 16: 2282-2293Crossref PubMed Scopus (90) Google Scholar). As expected, the large subunit of processed native FLICE that contains the catalytic cysteine bound BIO-DEVD-AMK (Fig. 3 c). Additionally, the unprocessed cleavage site mutant (FLICE(DD → AA)) also bound BIO-DEVD-AMK, indicating that the 1% activity resides in the single chain. FLICE(DDC → AAS), as anticipated, did not show any specific binding to BIO-DEVD-AMK. The specificity of the bands indicated was confirmed by competing the binding with a nonbiotinylated version of the DEVD tetrapeptide (Fig. 3 d). Taken together, these data are consistent with a model wherein FLICE zymogen possesses intrinsic low level caspase activity that upon approximation mediated by the adapter molecule Fas-associated death domain (FADD) attains a sufficient concentration to activate the apoptosis pathway. This study provides a remarkably simple solution to the chicken and egg conundrum of how the initiating caspase (FLICE) is proteolytically processed. We are grateful to S. L. Schreiber for helpful suggestions and discussions. We thank David Spencer for MFpk3Eu, Linda Clayton for BIO-DEVD, Ian Jones for his expertise in preparing the figures, and the following members of the Dixit lab for encouragement and discussions: Divya Chaudhary, Arul Chinnaiyan, Hangjun Duan, Shimin Hu, Eric Humke, Justin McCarthy, Karen O'Rourke, James Pan, and Claudius Vincenz.

Interleukin-1 (IL-1) interacts with cells through two types of binding molecules, IL-1 type I receptor (IL-1R I) and IL-1R II. The function of IL-1R II is unknown. In studies using monoclonal antibodies, IL-1 prolonged the in vitro survival of polymorphonuclear cells (PMN) through IL-1R I, and IL-4 antagonized the action of IL-1 by inducing expression and release of IL-1R II. Dexamethasone also induced expression and release of the IL-1R II in PMN. These results, together with the effect of antibodies to IL-1R on IL-1-induced production of cytokines in monocytes, indicate that IL-1 acts on myelomonocytic cells through IL-1R I and that IL-1R II inhibits IL-1 activity by acting as a decoy target for IL-1. The existence of multiple pathways of regulation emphasizes the need for tight control of IL-1 action.

Bacterial lipopolysaccharide (LPS)-mediated immune responses, including activation of monocytes, macrophages, and endothelial cells, play an important role in the pathogenesis of Gram-negative bacteria-induced sepsis syndrome. Activation of NF-κB is thought to be required for cytokine release from LPS-responsive cells, a critical step for endotoxic effects. Here we investigated the role and involvement of interleukin-1 (IL-1) and tumor necrosis factor (TNF-α) signal transducer molecules in LPS signaling in human dermal microvessel endothelial cells (HDMEC) and THP-1 monocytic cells. LPS stimulation of HDMEC and THP-1 cells initiated an IL-1 receptor-like NF-κB signaling cascade. In transient cotransfection experiments, dominant negative mutants of the IL-1 signaling pathway, including MyD88, IRAK, IRAK2, and TRAF6 inhibited both IL-1- and LPS-induced NF-κB-luciferase activity. LPS-induced NF-κB activation was not inhibited by a dominant negative mutant of TRAF2 that is involved in TNF signaling. LPS-induced activation of NF-κB-responsive reporter gene was not inhibited by IL-1 receptor antagonist. TLR2 and TLR4 were expressed on the cell surface of HDMEC and THP-1 cells. These findings suggest that a signal transduction molecule in the LPS receptor complex may belong to the IL-1 receptor/toll-like receptor (TLR) super family, and the LPS signaling cascade uses an analogous molecular framework for signaling as IL-1 in mononuclear phagocytes and endothelial cells. Bacterial lipopolysaccharide (LPS)-mediated immune responses, including activation of monocytes, macrophages, and endothelial cells, play an important role in the pathogenesis of Gram-negative bacteria-induced sepsis syndrome. Activation of NF-κB is thought to be required for cytokine release from LPS-responsive cells, a critical step for endotoxic effects. Here we investigated the role and involvement of interleukin-1 (IL-1) and tumor necrosis factor (TNF-α) signal transducer molecules in LPS signaling in human dermal microvessel endothelial cells (HDMEC) and THP-1 monocytic cells. LPS stimulation of HDMEC and THP-1 cells initiated an IL-1 receptor-like NF-κB signaling cascade. In transient cotransfection experiments, dominant negative mutants of the IL-1 signaling pathway, including MyD88, IRAK, IRAK2, and TRAF6 inhibited both IL-1- and LPS-induced NF-κB-luciferase activity. LPS-induced NF-κB activation was not inhibited by a dominant negative mutant of TRAF2 that is involved in TNF signaling. LPS-induced activation of NF-κB-responsive reporter gene was not inhibited by IL-1 receptor antagonist. TLR2 and TLR4 were expressed on the cell surface of HDMEC and THP-1 cells. These findings suggest that a signal transduction molecule in the LPS receptor complex may belong to the IL-1 receptor/toll-like receptor (TLR) super family, and the LPS signaling cascade uses an analogous molecular framework for signaling as IL-1 in mononuclear phagocytes and endothelial cells. lipopolysaccharide human dermal microvessel endothelial cells interleukin-1 IL-1 receptor IL-1R accessory protein interleukin-6 IL-1 receptor-associated kinase myeloid differentiation protein nuclear factor-κB NF-κB-inducing kinase reverse transcription-polymerase chain reaction toll-like receptor tumor necrosis factor tumor necrosis factor receptor-associated factor polyacrylamide gel electrophoresis Lipopolysaccharide (LPS),1 or endotoxin, is the major component of the outer surface of Gram-negative bacteria. LPS is a potent activator of cells of the immune and inflammatory systems, including macrophages, monocytes, and endothelial cells, and contributes to systemic changes known as septic shock (1Wenzel R.P. Pinsky M.R. Ulevitch R.J. Young L. Clin. Infect. Dis. 1995; 22: 407-413Crossref Scopus (123) Google Scholar, 2Rietschel E.T. Brade H. Holst O. Brade L. Muller-Loennies S. Mamat U. Zähringer U. Beckmann F. Seydel U. Brandenburg K. Ulmer A.J. Mattern T. Heine H. Schletter J. Loppnow H. Schönbeck U. Flad H.-D. Hauschidt S. Schade U.F. Di Padova F. Kusumoto S. Schumann R.R. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1996; 216: 40-81Google Scholar). LPS-induced activation of monocytes/macrophages is mediated through a cell surface receptor glycoprotein, known as membrane CD14 (mCD14). The binding of LPS to mCD14 is enhanced by LPS-binding protein, a plasma protein (3Ulevitch R.J. Tobias P.S. Curr. Opin. Immunol. 1994; 6: 125-130Crossref PubMed Scopus (229) Google Scholar). On the other hand, vascular endothelial cells do not express mCD14 and respond to LPS only in the presence of soluble CD14 (4Arditi M. Zhou J. Dorio R. Rong G.W. Goyert S.M. Kim K.S. Infect. Immun. 1993; 61: 3149-3156Crossref PubMed Google Scholar, 5Frey E.A. Miller D.S. Gullstein Jahr T. Sundan A. Bazil V. Espevik T. Finlay B.B. Wright S.D. J. Exp. Med. 1992; 176: 1665-1670Crossref PubMed Scopus (609) Google Scholar, 6Pugin J. Schurer-Maly C.-C. Leturcq D. Moriarty A. Ulevitch R.J. Tobias P.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993; 90: 2744-2751Crossref PubMed Scopus (731) Google Scholar). We (7Arditi M. Zhou J. Torres M. Durden D.L. Stins M. Kim K.S. J. Immunol. 1995; 155: 3994-4003PubMed Google Scholar) and others (8Weinstein S.L. Gold M.R. DeFranco A.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1991; 88: 4148-4152Crossref PubMed Scopus (302) Google Scholar, 9Weinstein S.L. Sanghera J.S. Lemke K. DeFranco A.L. Pelech S.L. J. Biol. Chem. 1992; 267: 14955-14962Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 10Reimann T. Büscher D. Hipskind R.A. Krautwald S. Lohmann-Matthes M.-L. Baccarini M. J. Immunol. 1994; 153: 5740-5749PubMed Google Scholar, 11Han J. Lee J.-D. Bibbs L. Ulevitch R.J. Science. 1994; 265: 808-811Crossref PubMed Scopus (2420) Google Scholar, 12Schumann R.R. Pfeil D. Lamping N. Kirschning C. Scherzinger G. Schlag P. Karawajew L. Herrmann F. Blood. 1996; 87: 2805-2814Crossref PubMed Google Scholar) have shown that protein tyrosine phosphorylation and activation of ERK1, ERK2, p38 mitogen-activated protein kinase, and c-Jun N-terminal kinase appear to be important for LPS-induced cellular activation. LPS rapidly induces nuclear factor-κB (NF-κB) in both monocytic (13Haeffner A. Thieblemont N. Deas O. Marelli O. Charpentier B. Senik A. Wright S.D. Haeffner-Cavaillon N. Hirsch F. J. Immunol. 1997; 158: 1310-1314PubMed Google Scholar, 14Cordle S.R. Donald R. Read M.A. Hawiger J. J. Biol. Chem. 1993; 268: 11803-11810Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) and endothelial cells (15Read M.A. Cordle S.R. Veach R.A. Carlisle C.D. Hawiger J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993; 90: 9887-9891Crossref PubMed Scopus (121) Google Scholar). Activation of NF-κB is required for release of proinflammatory cytokines, including interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6), and tumor necrosis factor (TNF) (16Baeuerle P.A. Baltimore D. Cell. 1996; 87: 13-20Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2935) Google Scholar, 17Baeuerle P.A. Curr. Biol. 1998; 8: R19-R22Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar). However, the molecular mechanisms of the signaling cascade induced by LPS to activate NF-κB are unknown. Furthermore, the signaling LPS receptor is still unidentified. The toll gene controls dorsoventral pattern formation during the early embryonic development of Drosophila melanogaster (18Belvin M.P. Anderson K.V. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 1996; 12: 393-416Crossref PubMed Scopus (690) Google Scholar). Toll initiates a signaling pathway homologous to the mammalian NF-κB activation cascade (18Belvin M.P. Anderson K.V. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 1996; 12: 393-416Crossref PubMed Scopus (690) Google Scholar). The toll family of receptors is defined by homology to the Drosophila toll protein (19Chaudhary P.M. Ferguson C. Nguyen V. Blood. 1998; 91: 4020-4027Crossref PubMed Google Scholar, 20Heguy A. Baldari C.T. Macchia G. Telford J.L. Melli M. J. Biol. Chem. 1992; 267: 2605-2609Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). The mammalian IL-1 receptor is a member of the toll family (18Belvin M.P. Anderson K.V. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 1996; 12: 393-416Crossref PubMed Scopus (690) Google Scholar). Five other mammalian family members (toll-like receptors 1 through 5, TLR1–5) have been identified, but their function is uncertain. Several TLRs, similar to IL-1R, have been observed to signal through the NF-κB pathway (19Chaudhary P.M. Ferguson C. Nguyen V. Blood. 1998; 91: 4020-4027Crossref PubMed Google Scholar, 20Heguy A. Baldari C.T. Macchia G. Telford J.L. Melli M. J. Biol. Chem. 1992; 267: 2605-2609Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 21Rock F.L. Hardiman G. Timans J.C. Kastelein R.A. Bazan J.F. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 588-593Crossref PubMed Scopus (1458) Google Scholar, 22Medzhitov R. Preston-Hurlburt P. Janeway Jr., C.A. Nature. 1997; 388: 394-397Crossref PubMed Scopus (4458) Google Scholar). LPS signaling also leads to activation of NF-κB, and recent studies suggested that a toll-like receptor (TLR) might be a signaling receptor that is activated by LPS (22Medzhitov R. Preston-Hurlburt P. Janeway Jr., C.A. Nature. 1997; 388: 394-397Crossref PubMed Scopus (4458) Google Scholar, 23Yang R.-B. Mark M.R. Gray A. Huang A. Xie M.H. Zhang M. Goddard A. Wood W.I. Gurney A.L. Godowski P.J. Nature. 1998; 395: 284-288Crossref PubMed Scopus (1102) Google Scholar). In these reports, expression of TLR2 in LPS-unresponsive human embryonic kidney cells (293 cells) enabled these cells to respond to LPS stimulation (22Medzhitov R. Preston-Hurlburt P. Janeway Jr., C.A. Nature. 1997; 388: 394-397Crossref PubMed Scopus (4458) Google Scholar, 23Yang R.-B. Mark M.R. Gray A. Huang A. Xie M.H. Zhang M. Goddard A. Wood W.I. Gurney A.L. Godowski P.J. Nature. 1998; 395: 284-288Crossref PubMed Scopus (1102) Google Scholar). These investigators observed that LPS binds to a TLR2 extracellular domain and suggested that TLR2 is a candidate for a long sought LPS receptor, although the data were generated from a transfected and normally LPS-unresponsive cell line (22Medzhitov R. Preston-Hurlburt P. Janeway Jr., C.A. Nature. 1997; 388: 394-397Crossref PubMed Scopus (4458) Google Scholar, 23Yang R.-B. Mark M.R. Gray A. Huang A. Xie M.H. Zhang M. Goddard A. Wood W.I. Gurney A.L. Godowski P.J. Nature. 1998; 395: 284-288Crossref PubMed Scopus (1102) Google Scholar). A recent study in the LPS-resistant C3H-HeJ mice has implicated another toll homologue (TLR4) as a signal-transducing component in the LPS receptor complex (24Kirschning C.J. Wesche H. Ayres T.M. Rothe M. J. Exp. Med. 1998; 188: 2091-2097Crossref PubMed Scopus (655) Google Scholar). It is known that the IL-1 signaling pathway in mammals is strikingly similar to the toll signaling pathway in Drosophila(19Chaudhary P.M. Ferguson C. Nguyen V. Blood. 1998; 91: 4020-4027Crossref PubMed Google Scholar, 20Heguy A. Baldari C.T. Macchia G. Telford J.L. Melli M. J. Biol. Chem. 1992; 267: 2605-2609Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 21Rock F.L. Hardiman G. Timans J.C. Kastelein R.A. Bazan J.F. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 588-593Crossref PubMed Scopus (1458) Google Scholar, 22Medzhitov R. Preston-Hurlburt P. Janeway Jr., C.A. Nature. 1997; 388: 394-397Crossref PubMed Scopus (4458) Google Scholar). The molecular events linking the IL-1 receptor (IL-1R) signaling complex to the induction of NF-κB have been recently characterized. Upon binding of IL-1 to its receptors (IL-1R), IL-1R associates with the IL-1 receptor accessory protein (IL-1RAcP) (26Huang J. Gao X. Li S. Cao Z. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 12829-12832Crossref PubMed Scopus (195) Google Scholar,27Croston G.E. Cao Z. Goeddel D.V. J. Biol. Chem. 1995; 270: 16514-16517Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (154) Google Scholar). The complex then recruits and activates an adapter protein myeloid differentiation protein (MyD88) (28Wesche H. Henzel W.J. Shillinglaw W. Li W. Cao Z. Immunity. 1997; 7: 837-847Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (922) Google Scholar, 29Burns K. Martinon F. Esslinger C. Pahl H. Schneider P. Bodmer J.-L. Di Marco F. French L. Tschopp J. J. Biol. Chem. 1998; 273: 12203-12209Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (521) Google Scholar). MyD88 in turn recruits two distinct putative serine-threonine kinases, namely IL-1 receptor-activated kinase (IRAK) and IRAK2, to the receptor complex (30Muzio M. Ni J. Feng P. Dixit V.M. Science. 1997; 278: 1612-1615Crossref PubMed Scopus (988) Google Scholar). IRAK and IRAK2 interact subsequently with the adapter molecule, TNF receptor-associated factor 6 (TRAF6) (31Cao Z. Xiong J. Takeuchi M. Kurama T. Goeddel D.V. Science. 1996; 383: 443-446Google Scholar, 32Muzio M. Natoli G. Saccani S. Levrero M. Mantovani A. J. Exp. Med. 1998; 187: 2097-2101Crossref PubMed Scopus (527) Google Scholar), which links them to the protein kinase NF-κB-inducing kinase (NIK) (33Song H.Y. Regnier C.H. Kirschning C. Goeddel D.V. Cao Z. Rothe M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 9792-9796Crossref PubMed Scopus (506) Google Scholar). NIK activates the IκB kinase complex (IKKα and IKKβ) that directly phosphorylates IκB (34DiDonato J.A. Hayakawa M. Rothwarf D.M. Zandi E. Karin M. Nature. 1997; 388: 548-554Crossref PubMed Scopus (1917) Google Scholar, 35Stancovski I. Baltimore D. Cell. 1997; 91: 299-302Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (456) Google Scholar, 36Scheidereit C. Nature. 1998; 395: 225-226Crossref PubMed Scopus (55) Google Scholar). The phosphorylation of IκB initiates ubiquitin-proteasome-mediated degradation and liberates and activates NF-κB (16Baeuerle P.A. Baltimore D. Cell. 1996; 87: 13-20Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2935) Google Scholar, 17Baeuerle P.A. Curr. Biol. 1998; 8: R19-R22Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar). On the other hand, TNF and its receptor complex activate TRAF2, but not TRAF6 (37Rothe M. Sarma V. Dixit V.M. Goeddel D.V. Science. 1995; 269: 1421-1427Crossref Scopus (980) Google Scholar, 38Takeuchi M. Rothe M. Goeddel D.V. J. Biol. Chem. 1996; 271: 19935-19942Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (282) Google Scholar). Downstream signaling pathways of IL-1 and TNF distal to TRAF6 and TRAF2 converge (16Baeuerle P.A. Baltimore D. Cell. 1996; 87: 13-20Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2935) Google Scholar, 17Baeuerle P.A. Curr. Biol. 1998; 8: R19-R22Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar). In this study, we tested the hypothesis that LPS activates NF-κB through IL-1 signaling molecules, namely MyD88, IRAK, IRAK2, and TRAF6 in two LPS-responsive cell types. Dominant negative mutants of these signaling elements were transfected into human monocytes (THP-1 cells) and human dermal endothelial cells together with a NF-κB-responsive reporter gene, and LPS-induced NF-κB luciferase activity was measured. Our results indicate that LPS transduces signals of NF-κB activation utilizing the IL-1 signaling molecules in both monocytic and endothelial cells. Human THP-1 cells (from ATCC) were cultured in RPMI medium with 10% fetal calf serum. The immortalized human dermal endothelial cells (generous gift of Dr. Candal of the Center for Disease Control, Atlanta) were cultured in MCDB-131 medium with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 2 mm glutamine, and 100 μg/ml penicillin and streptomycin in 6-well plates. Dominant negative expression vectors of MyD88, IRAK, IRAK2, TRAF2, TRAF6, and NIK have been characterized and described before (30Muzio M. Ni J. Feng P. Dixit V.M. Science. 1997; 278: 1612-1615Crossref PubMed Scopus (988) Google Scholar, 32Muzio M. Natoli G. Saccani S. Levrero M. Mantovani A. J. Exp. Med. 1998; 187: 2097-2101Crossref PubMed Scopus (527) Google Scholar, 33Song H.Y. Regnier C.H. Kirschning C. Goeddel D.V. Cao Z. Rothe M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 9792-9796Crossref PubMed Scopus (506) Google Scholar). Cells were used for transfection with FuGene 6 Transfection Reagent (Boehringer Mannheim) following the manufacturer's instructions in RPMI with 10% serum. Reporter genes pCMV-β-galactosidase (0.5 μg) and ELAM-NF-κB-luciferase (2 μg) and pcDNA3 empty vector or dominant negative mutants of MyD88, IRAK, TRAF6, TRAF2, and NIK (3 μg each) were used. After a 24-h transfection, cells were stimulated for 6 h with 100 ng/ml LPS. Cells were then lysed, and luciferase activity was measured with a Promega kit (Promega, Madison, WI) and a luminometer. β-Galactosidase activity was determined by the calorimetric method to normalize transfection efficiency as described earlier (30Muzio M. Ni J. Feng P. Dixit V.M. Science. 1997; 278: 1612-1615Crossref PubMed Scopus (988) Google Scholar). Data shown are means of two independent experiments. Transfection was carried out using the same method described above. The amount of NF-κB luciferase construct DNA was 1.5 μg, and empty vector and various dominant negative constructs were 2 μg each. Cells were transfected for 24 h and stimulated for 6 h with 100 ng/ml LPS, human TNF-α (200 units/ml, Genzyme, Cambridge, MA), recombinant human IL-1β (400 units/ml, Genzyme), and recombinant IL-1 receptor antagonist (100 ng/ml, R&D Systems, Minneapolis, MN) in 2 ml of serum-containing MCDB-131 medium. Total RNA was isolated from HDMEC and THP-1 cells using a Qiagen kit (Valencia, CA) and treated with RNase-free DNase I. For RT reaction, the SuperScriptTM Preamplification system (Life Technologies, Inc.) was applied. PCR amplification was performed withTaq polymerase (Qiagen, Valencia, CA) for 28 cycles at 95 °C for 40 s, 54 °C for 40 s, and 72 °C for 1 min. PCR primers for TLR2 were 5′-GCCAAAGTCTTGATTGATTGG and 5′-TTGAAGTTCTCCAGCTCCTG. PCR primers for TLR4 were 5′-TGGATACGTTTCCTTATAAG and 5′-GAAATGGAGGCACCCCTTC. GAPDH primers were obtained from CLONTECH. Smeared THP-1 cell and cultured HDMEC on slides were fixed with acetone for 5 min and then stained with rabbit anti-TLR2 and TLR-4 antibody (1:100) and rabbit IgG following the instructions on a DACO immunostaining kit. The anti-TLR2 and anti-TLR4 antisera were raised against synthetic peptides (extracellular domains of TLR2 and TLR4) by BABCO (Richmond, CA). The sequence of the synthetic peptide for TLR2 was a 27-amino acid peptide, starting at amino acid residue 277 of the mature hTLR2 (FRASDNDRVIDPGKVETLTIRRLHIPR), whereas the peptide for TLR4 was a 23-amino acid peptide, starting at amino acid 201 of mature hTLR4 (FKEIRHKLTLRNNFDLSLNVMKT). Following immunoperoxidase staining, the representative fields were photographed. THP-1 and HDMEC cells were lysed in Laemmli buffer and separated with a 10% SDS-PAGE gel. The protein was then transferred onto a polyvinylidene difluoride membrane, and then the membrane was probed with anti-TLR2, anti-TLR4 antibodies, and prebleeds corresponding to each antibody (1:2,000). After incubation with horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibody, the membrane was developed with an enhanced chemiluminescence ECL detection kit. A series of defense mechanisms are triggered in vertebrates and invertebrates in response to Gram-negative bacterial infections by sensing the presence of LPS (1Wenzel R.P. Pinsky M.R. Ulevitch R.J. Young L. Clin. Infect. Dis. 1995; 22: 407-413Crossref Scopus (123) Google Scholar, 2Rietschel E.T. Brade H. Holst O. Brade L. Muller-Loennies S. Mamat U. Zähringer U. Beckmann F. Seydel U. Brandenburg K. Ulmer A.J. Mattern T. Heine H. Schletter J. Loppnow H. Schönbeck U. Flad H.-D. Hauschidt S. Schade U.F. Di Padova F. Kusumoto S. Schumann R.R. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1996; 216: 40-81Google Scholar, 3Ulevitch R.J. Tobias P.S. Curr. Opin. Immunol. 1994; 6: 125-130Crossref PubMed Scopus (229) Google Scholar). LPS-induced signal relay is thought to be initiated following its binding to specific cellular receptors which then triggers intracellular signaling pathways leading to the activation of NF-κB (4Arditi M. Zhou J. Dorio R. Rong G.W. Goyert S.M. Kim K.S. Infect. Immun. 1993; 61: 3149-3156Crossref PubMed Google Scholar, 5Frey E.A. Miller D.S. Gullstein Jahr T. Sundan A. Bazil V. Espevik T. Finlay B.B. Wright S.D. J. Exp. Med. 1992; 176: 1665-1670Crossref PubMed Scopus (609) Google Scholar, 6Pugin J. Schurer-Maly C.-C. Leturcq D. Moriarty A. Ulevitch R.J. Tobias P.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993; 90: 2744-2751Crossref PubMed Scopus (731) Google Scholar, 7Arditi M. Zhou J. Torres M. Durden D.L. Stins M. Kim K.S. J. Immunol. 1995; 155: 3994-4003PubMed Google Scholar, 8Weinstein S.L. Gold M.R. DeFranco A.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1991; 88: 4148-4152Crossref PubMed Scopus (302) Google Scholar, 9Weinstein S.L. Sanghera J.S. Lemke K. DeFranco A.L. Pelech S.L. J. Biol. Chem. 1992; 267: 14955-14962Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 10Reimann T. Büscher D. Hipskind R.A. Krautwald S. Lohmann-Matthes M.-L. Baccarini M. J. Immunol. 1994; 153: 5740-5749PubMed Google Scholar, 11Han J. Lee J.-D. Bibbs L. Ulevitch R.J. Science. 1994; 265: 808-811Crossref PubMed Scopus (2420) Google Scholar, 12Schumann R.R. Pfeil D. Lamping N. Kirschning C. Scherzinger G. Schlag P. Karawajew L. Herrmann F. Blood. 1996; 87: 2805-2814Crossref PubMed Google Scholar) in various LPS-responsive cell types. To date, the identification of a functional, signal-transducing component of the putative LPS receptor complex and the signaling pathways involved in LPS-induced activation of NF-κB have remained elusive. Recent findings suggested that LPS might use signaling molecules of the TLR and IL-1R superfamilies to transduce signals (23Yang R.-B. Mark M.R. Gray A. Huang A. Xie M.H. Zhang M. Goddard A. Wood W.I. Gurney A.L. Godowski P.J. Nature. 1998; 395: 284-288Crossref PubMed Scopus (1102) Google Scholar, 24Kirschning C.J. Wesche H. Ayres T.M. Rothe M. J. Exp. Med. 1998; 188: 2091-2097Crossref PubMed Scopus (655) Google Scholar). To investigate the potential involvement of IL-1 and TNF signal transducers in LPS signaling in two LPS-responsive cell types, HDMEC and THP-1 cells, we cotransfected dominant negative constructs of various components of the NF-κB signaling cascades for IL-1 and TNF together with NF-κB-luciferase reporter gene. LPS induced the activation of NF-κB in a time- (Fig.1 A) and dose-dependent (Fig. 1 B) manner in THP-1 cells. Activation of NF-κB reached a maximum at a LPS concentration of 100 ng/ml and when cells were stimulated with LPS for 6 h (Fig. 1,A and B). Similar results were also obtained from endothelial cells. A mutant version of MyD88 (ΔMyD88), encoding only for the COOH-terminal toll-IL-1R-like domain, which abrogates IL-1R-induced NF-κB activation (30Muzio M. Ni J. Feng P. Dixit V.M. Science. 1997; 278: 1612-1615Crossref PubMed Scopus (988) Google Scholar), inhibited both LPS- and IL-1-mediated NF-κB activation (Figs. 1 C and 2, A and B) but not TNF-induced NF-κB activation (Fig.2 C). IRAK and IRAK-2 are two additional proximal mediators of the IL-1R signaling complex (30Muzio M. Ni J. Feng P. Dixit V.M. Science. 1997; 278: 1612-1615Crossref PubMed Scopus (988) Google Scholar). Dominant negative constructs of IRAK (ΔIRAK) and IRAK2 (ΔIRAK2) inhibited both LPS- (Figs. 1 D and 2 A) and IL-1R-mediated NF-κB activation (Fig. 2 B), but not TNF-induced NF-κB activation (Fig. 2 C). NF-κB activation induced by various cytokine receptors is mediated by members of the TRAF adapter family. While TRAF2 plays a crucial role in NF-κB activation by TNFR-1 and TNFR-2 (37Rothe M. Sarma V. Dixit V.M. Goeddel D.V. Science. 1995; 269: 1421-1427Crossref Scopus (980) Google Scholar, 38Takeuchi M. Rothe M. Goeddel D.V. J. Biol. Chem. 1996; 271: 19935-19942Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (282) Google Scholar), TRAF6 has been implicated in IL-1 signaling (31Cao Z. Xiong J. Takeuchi M. Kurama T. Goeddel D.V. Science. 1996; 383: 443-446Google Scholar, 32Muzio M. Natoli G. Saccani S. Levrero M. Mantovani A. J. Exp. Med. 1998; 187: 2097-2101Crossref PubMed Scopus (527) Google Scholar). Therefore, we next determined whether dominant negative versions of TRAF6 (ΔTRAF6) or TRAF2 (ΔTRAF2) could act to inhibit LPS-induced NF-κB activity. ΔTRAF-6 but not ΔTRAF2 significantly impaired LPS-induced NF-κB activation, suggesting that TRAF6 may act as an additional downstream mediator of LPS-induced NF-κB activation cascade (Figs. 1 D and2 A). ΔTRAF2 blocked TNF-induced NF-κB activation in endothelial cells (Fig. 2 C), but not LPS-induced NF-κB activation (Figs. 1 D and 2 A). Because the pathways for IL-1 and TNF-α signaling converge at the level of NIK for NF-κB activation, we next investigated whether dominant negative NIK mutant (ΔNIK) would block LPS-induced, as well as IL-1- and TNF-induced, NF-κB activation. As expected, ΔNIK blocked NF-κB activation induced by LPS, IL-1, and TNF-α (Fig. 2). IL-1 receptor antagonist had no effect on LPS-induced NF-κB activation (Fig. 2 A) but inhibited IL-1-induced NF-κB activation in endothelial cells (Fig. 2 B). This observation suggests that NF-κB activation that we measured following 6 h of LPS stimulation of cells is not due to an autocrine effect such as LPS-induced IL-1 release from endothelial cells. These data suggest that LPS stimulation of endothelial cells and THP-1 cells triggers an IL-1R-like signal relay leading to activation of NF-κB (Fig. 5). Further support for this concept is provided by the observation of a 15-year-old girl with recurrent infections who was found to be resistant to both LPS and IL-1 stimulation in vivo and in vitro (39Kuhns D.B. Long Priel D.A. Gallin J.I. J. Immunol. 1997; 158: 3959-3964PubMed Google Scholar). The authors suggested that resistance to LPS and IL-1 was due to a defect very early in the common signaling pathway for LPS and IL-1 (39Kuhns D.B. Long Priel D.A. Gallin J.I. J. Immunol. 1997; 158: 3959-3964PubMed Google Scholar). The experiments with IL-1R antagonist also suggest that LPS does not use IL-1 receptor to transduce signals in endothelial cells. Although recent findings imply that TLR2 or other members of the TLR family, which use the IL-1R signaling pathway, might be an important mediator for LPS signaling (23Yang R.-B. Mark M.R. Gray A. Huang A. Xie M.H. Zhang M. Goddard A. Wood W.I. Gurney A.L. Godowski P.J. Nature. 1998; 395: 284-288Crossref PubMed Scopus (1102) Google Scholar, 24Kirschning C.J. Wesche H. Ayres T.M. Rothe M. J. Exp. Med. 1998; 188: 2091-2097Crossref PubMed Scopus (655) Google Scholar), further studies are needed to identify naturally existing LPS receptors in LPS-responsive cells. Beutler and coworkers (25Poltorak A. He X. Smirnova I. Liu M.-Y. Van Huffel C. Du X. Birdwell D. Alejos E. Silva M. Galanos C. Freudenberg M. Ricciardi-Castagnoli P. Layton B. Beutler B. Science. 1998; 282: 2085-2088Crossref PubMed Scopus (6478) Google Scholar) recently reported that TLR4 is the protein encoded by the LPS gene, which is mutated in the LPS-non-responsive C3H-HeJ mice. To investigate the expression of the TLR2 and TLR4 message in HDMEC and THP-1 cells, we used RT-PCR. Human THP-1 and HDMEC were found to express significant levels of both TLR2 and TLR4 mRNA (Fig.3). Expression levels of TLR2 appeared to be stronger in THP-1 whereas the expression level of TLR4 appeared to be stronger in HDMEC. Expression of TLR2 and TLR4 was confirmed with Northern analysis in THP-1 cells. Immunohistochemistry and immunoblotting data demonstrate that TLR2 and TLR4 proteins are expressed on THP-1 cells and HDMEC (Fig.4). Staining was absent in THP-1 and HDMEC incubated without the first antibody or incubated with rabbit IgG. These results suggest that TLR2 and TLR4 are expressed in endothelial and monocytic cells and may represent a signaling component of a cellular receptor for LPS which signals through an IL-1-like pathway (Fig. 5).Figure 4Immunostaining and immunoblotting. Inpanel A, THP-1 cells (a, c, and e) and HDMEC cells (b, d, andf) were immunostained with rabbit IgG (a andb), anti-TLR2 (c and d), and anti-TLR4 (e and f) (1:100). In panel B, THP-1 and HDMEC cell lysates were resolved with SDS-PAGE and probed with anti-TLR2, anti-TLR4 antibodies, and corresponding prebleeds. Molecular mass markers are indicated at theright. The apparent molecular masses for TLR2 and TLR4 were 85 kDa and 92 kDa, respectively.View Large Image Figure ViewerDownload (PPT) In summary, we have demonstrated in endothelial and THP-1 cells that LPS-induced NF-κB activation is mediated by IL-1R signaling molecules, namely MyD88, IRAK, IRAK2, and TRAF6, but not the TNF signaling molecule, TRAF2. We have also shown that TLR2 and TLR4 are expressed on the cell surface of two LPS-responsive cell types, endothelial cells and THP-1 cells. These data strongly suggest that a crucial signaling component in the LPS receptor complex may belong to the IL-1 receptor/TLR superfamily, and the LPS signaling cascade uses an analogous molecular framework for signaling as IL-1. MyD88 appears to represent the most upstream mediator of the LPS-mediated signaling cascade, which ultimately activates NF-κB, thus driving transcriptional activation of several cytokines. Thus, MyD88 may represent a potentially useful therapeutic target to control the molecular switch from innate to the adaptive immune response.

The human homologue of Drosophila Toll (hToll) is a recently cloned receptor of the interleukin 1 receptor (IL-1R) superfamily, and has been implicated in the activation of adaptive immunity. Signaling by hToll is shown to occur through sequential recruitment of the adapter molecule MyD88 and the IL-1R–associated kinase. Tumor necrosis factor receptor–activated factor 6 (TRAF6) and the nuclear factor κB (NF-κB)–inducing kinase (NIK) are both involved in subsequent steps of NF-κB activation. Conversely, a dominant negative version of TRAF6 failed to block hToll-induced activation of stress-activated protein kinase/c-Jun NH2-terminal kinases, thus suggesting an early divergence of the two pathways.

A missense mutation in the cytoplasmic domain of the Toll-like receptor-4 (TLR-4) has been identified as the defect responsible for lipopolysaccharide (LPS) hyporesponsiveness in C3H/HeJ mice. TLR-4 and TLR-2 have recently been implicated in LPS signaling in studies where these receptors were overexpressed in LPS non-responsive 293 human embryonic kidney cells. However, the signaling role of TLR-4 or TLR-2 in human cells with natural LPS response remains largely undefined. Here we show that human dermal microvessel endothelial cells (HMEC) and human umbilical vein endothelial cells express predominantly TLR-4 but very weak TLR-2 and respond vigorously to LPS but not toMycobacterium tuberculosis 19-kDa lipoprotein. Transient transfection of non-signaling mutant forms of TLR-4 and anti-TLR-4 monoclonal antibody inhibited LPS-induced NF-κB activation in HMEC, while a monoclonal antibody against TLR-2 was ineffective. In contrast to LPS responsiveness, the ability of HMEC to respond to 19-kDa lipoprotein correlated with the expression of TLR-2. Transfection of TLR-2 into HMEC conferred responsiveness to 19-kDa lipoprotein. These data indicate that TLR-4 is the LPS signaling receptor in HMEC and that human endothelial cells (EC) express predominantly TLR-4 and weak TLR-2, which may explain why they do not respond to 19-kDa lipoprotein. The differential expression of TLRs on human EC may have important implications in the participation of vascular EC in innate immune defense mechanisms against various infectious pathogens, which may use different TLRs to signal.

When ectopically expressed in animal cells, cytokine response modifier A (CrmA), a product of the cowpox virus, prevents programmed cell death initiated by a variety of stimuli. Since CrmA is a proteinase inhibitor, its target is probably a protease that promotes cell death. The identification of this target is crucial in delineating essential regulation points that modulate the apoptotic program. We have compared the kinetics of interaction of CrmA with five proteases that may play a role in apoptosis. Four of the proteases, all members of the caspase family, are inhibited with widely different rates and affinities ranging over 5 orders of magnitude. One is not inhibited at all under the experimental conditions. CrmA is quite selective in its ability to inhibit caspases, showing the highest affinity for interleukin-1beta-converting enzyme and the second highest for the caspase FLICE (Ki = 0.95 nM), identified as a component of the intracellular signaling complex recruited by ligation of the death receptor Fas. On the basis of comparative inhibitor kinetics, we propose that CrmA is unlikely to inhibit the caspases Yama, Mch2, or LAP3 in vivo but that its inhibition of FLICE is of a magnitude for this protease to be a key target of CrmA during Fas-mediated apoptosis. Therefore, our results support the hypothesis that FLICE catalyzes a crucial step in the promotion of cell death.