Abstract The Serine Peptidase Inhibitor, Kazal type 1 (SPINK1) overexpression represents ~10-25% of the prostate cancer (PCa) cases associated with shorter recurrence-free survival and poor prognosis. Nonetheless, androgen-deprivation therapy (ADT) remains the mainstay treatment for locally advanced and metastatic PCa patients. However, majority of these individuals eventually progress to castration-resistant stage, and a subset of these patients develop ADT-induced neuroendocrine PCa. Despite adverse effects of ADT, possible role of androgen signaling in SPINK1-mediated prostate oncogenesis remains unexplored. Here, we show that androgen receptor (AR) and its corepressor, the RE1-silencing transcription factor (REST), occupy SPINK1 promoter and functions as a direct transcriptional repressor of SPINK1 , thus blocking AR signaling via ADT relieves its repression, leading to SPINK1 upregulation. In agreement, an inverse association between SPINK1 levels and AR expression was observed across multiple PCa cohorts, and in neuroendocrine differentiated cells. While, lineage reprogramming factor SOX2 in turn binds to SPINK1 promoter leading to its transactivation in androgen-deprived conditions with concomitant increase in neuroendocrine markers. Additionally, we also confirm the role of SPINK1 in epithelial-mesenchymal transition, drug resistance, stemness and cellular plasticity. Moreover, we show that Casein Kinase 1 inhibitor stabilizes the REST levels, which in cooperation with AR, conjures transcriptional repression of SPINK1 expression, and impedes SPINK1-mediated oncogenesis. Collectively, our findings provide a plausible explanation to the paradoxical clinical outcomes of ADT, possibly due to increased SPINK1 levels. This study highlights the need to take a well-informed decision prior to ADT and develop alternative therapeutic strategies for castrate-resistant PCa patients.

Abstract Nearly half of the prostate cancer (PCa) cases show elevated levels of ERG oncoprotein due to TMPRSS2-ERG gene fusion. Here, we demonstrate ERG mediated upregulation of Distal-less homeobox-1 (DLX1), an established PCa biomarker. Using series of functional assays, we show DLX1 elicits oncogenic properties in prostate epithelial cells, and abrogating its function leads to reduced tumor burden in mouse xenografts. Clinically, ∼60% of the PCa patients exhibit high DLX1 levels, while ∼50% of these cases also harbor elevated ERG associated with aggressive disease and poor survival probability. Mechanistically, we show that ERG gets recruited onto DLX1 promoter and interacts with its enhancer-bound androgen receptor (AR) and FOXA1 to regulate DLX1 expression in TMPRSS2-ERG positive cases. Alternatively, in ERG-negative cases, DLX1 is regulated by AR/AR-V7 and FOXA1. Importantly, BET bromodomain inhibitors disrupt the transcriptional regulators of DLX1 and its associated oncogenic properties, signifying their efficacy in treatment of DLX1-positive PCa patients.

Abstract Elevated Serine Peptidase Inhibitor, Kazal type 1 (SPINK1) levels in ∼10-25% of prostate cancer (PCa) patients associate with aggressive phenotype, for which there are limited treatment choices and dismal clinical outcomes. Using an integrative proteomics approach involving label-free phosphoproteome and proteome profiling, we delineated the downstream signaling pathways involved in SPINK1-mediated tumorigenesis in PCa, and identified tyrosine kinase KIT as a highly enriched kinase. Furthermore, high to moderate levels of KIT expression was detected in ∼85% of SPINK1-positive PCa specimens. KIT signaling regulates SPINK1-associated oncogenesis, and treatment with KIT inhibitor reduces tumor growth and distant metastases in preclinical mice models. Mechanistically, KIT signaling modulates WNT/β-catenin pathway and confers stemness-related features in PCa. Notably, inhibiting KIT signaling restores AR/REST levels, forming a feedback loop enabling SPINK1 repression. Overall, we uncover the role of KIT signaling downstream of SPINK1 in maintaining lineage plasticity and provide new treatment modalities for advanced-stage SPINK1-positive subtype.

Prostate cancer is frequently multifocal. Although there may be morphological variation, the genetic underpinnings of each tumor are not clearly understood. To assess the inter and intra tumor molecular heterogeneity in prostate biopsy samples, we developed a combined immunohistochemistry and RNA in situ hybridization method for the simultaneous evaluation of ERG, SPINK1, ETV1, and ETV4. Screening of 601 biopsy cores from 120 consecutive patients revealed multiple alterations in a mutually exclusive manner in 37% of patients, suggesting multifocal tumors with considerable genetic differences. Furthermore, the incidence of molecular heterogeneity was higher in African Americans patients compared to Caucasian American patients. About 47% of the biopsy cores with discontinuous tumor foci showed clonal differences with distinct molecular aberrations. ERG positivity occurred predominantly in low Gleason grade cancer, whereas ETV4 expression was observed mostly in high Gleason grade cancer. Further studies revealed correlation between the incidence of molecular markers and clinical and pathologic findings, suggesting potential implications for diagnostic pathology practice, such as defining dominant tumor nodules and discriminating juxtaposed but molecularly different tumors of different grade patterns.

Serine Peptidase Inhibitor, Kazal type-1 (SPINK1) overexpression defines the second largest subtype of prostate cancer (PCa), however, molecular mechanisms underlying its upregulation remains poorly understood. Here, we identified a critical role of miRNA-338-5p and miRNA-421 in post-transcriptional regulation of SPINK1. We show that SPINK1-positive PCa patients also exhibit overexpression of Polycomb group member EZH2, which confers repressive trimethylation marks on lysine 27 of histone 3 (H3K27me3) on the regulatory regions of these miRNAs. Further, we demonstrate that oncogenic lncRNA MALAT1 interacts with EZH2, which in turn are targeted by miRNA-338-5p/miRNA-421, thus reinforcing a repressive molecular circuitry. Moreover, ectopic expression of miRNA-338-5p/-421 in SPINK1-positive PCa cells abrogate oncogenic properties including EMT, stemness and drug resistance, resulting in reduced tumor growth and distant metastases in mice. Collectively, we show that restoring miRNA-338-5p/miRNA-421 expression using epigenetic drugs or synthetic miRNA mimics could serve as a potential adjuvant therapy for treatment of SPINK1-positive malignancies.

Analysis of next generation transcriptome sequencing data of prostate cancer identified a novel gene fusion formed by the fusion of a protein coding gene (KLK4) with a non-coding pseudogene (KLKP1) and expression of its cognate protein. Screening of 659 prostate cancer TMA showed about 32% of positive cases predominantly expressed in higher Gleason grade tumors. Concomitant expression with ERG but not with SPINK1 and other ETS fusion positive tumors. Fusion gene expression potentially regulated by AR and ERG. Antibody specific to the KLK4-KLKP1 fusion protein was validated by immunohistochemistry and western blot methods. Oncogenic properties were validated by in vitro and in vivo functional studies. Clinical data analysis shows significant association with prostate cancer in young men and overall survival analysis indicate favorable prognosis. Non-invasive detection in urine samples has been confirmed. Taken together, we present a novel biomarker for routine screening of high Gleason grade prostate cancer at diagnosis.

Expression profiles of ETS related genes and SPINK1 in early onset prostate cancer have not been thoroughly explored. We retrieved 151 radical prostatectomy specimens from young men with prostate cancer (<55yrs) and characterized the expression of ERG, SPINK1, ETV1 and ETV4 by dual immunohistochemistry and dual RNA in-situ hybridization. Age, race, family history, preoperative prostate-specific antigen, biochemical recurrence and pathological variables using whole mount radical prostatectomy tissue were collected. 313 tumor nodules from 151 men including 68 (45%) Caucasians and 61 (40%) African Americans. Positive family history of prostate cancer was observed in 65 (43%) patients. Preoperative prostate-specific antigen ranged from 0.3 to 52.7 ng/ml (mean 7.04). Follow-up period ranged from 1 to 123.7 months (Mean 30.3). Biochemical recurrence was encountered in 8/151 (5%). ERG overexpression was observed in 85/151 (56%) cases, followed by SPINK1 in 61/151 (40%), ETV1 in 9/149 (6%), and ETV4 in 4/141 (3%). There were 25/151 (17%) cases showing both ERG and SPINK1 overexpression within different regions of either the same tumor focus or different foci. Higher frequency of ERG overexpression was seen in younger patients (≤ 45 years old) (76% vs. 49%, p = 0.002213), Caucasian men (71% vs. 41% p = 0.000707), organ-confined tumors (64% vs. 33%, p = 0.00079), and tumors of Grade Groups 1 and 2 (62% vs. 26%, p = 0.008794). SPINK1 overexpression was more in African American men (68% vs. 26%, p = 0.00008), in tumors with high tumor volume (> 20%) and with anterior located tumors. ETV1 and ETV4 demonstrated rare overexpression in these tumors, particularly in the higher-grade tumors. This study expands the knowledge of the clonal evolution of multifocal cancer in young patients and support differences in relation to racial background and genetics of prostate cancer.