We have examined components of the preintegration complex of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and have analyzed features which govern the association of these components. HIV-1 nucleoprotein complexes, isolated from nuclear and cytoplasmic extracts of CD4+ cells after acute virus infection, contained viral RNA and DNA in association with viral matrix (MA), integrase (IN), and reverse transcriptase (RT) antigens but not capsid (CA) antigens and possessed integration activity in vitro. Association of IN but not RT or MA antigens with viral DNA was detergent-stable. Analysis of viral DNA synthesis and nuclear import of viral nucleoprotein complexes in the presence of a reversible RT inhibitor demonstrated that reverse transcription of viral RNA could be completed entirely in the host cell nucleus. Our studies demonstrate structural and functional features of the nucleoprotein (preintegration) complex of HIV-1 which are pertinent to the understanding of early events in the lentiviral life cycle.

Abstract Recombinant plasmid vectors are versatile tools which have facilitated discoveries in molecular biology, genetics, proteomics, and many other fields. As the enzymatic and bacterial processes used to create recombinant DNA can introduce errors, sequence validation is an essential step in plasmid assembly. Sanger sequencing is the current standard for plasmid validation, however this method is limited by an inability to sequence through complex secondary structure and lacks scalability when applied to full-plasmid sequencing of multiple plasmids due to read-length limits. While next-generation sequencing (NGS) does provide full-plasmid sequencing at scale, it is impractical and costly when utilized outside of library-scale validation. Here we present OnRamp (Oxford nanopore-based Rapid Analysis of Multiplexed Plasmids), an alternative method for routine plasmid validation which combines the advantages of NGS’s full plasmid coverage and scalability with Sanger’s affordability and accessibility by leveraging nanopore’s novel long-read sequencing technology. We include customized wet-lab protocols for plasmid preparation along with a pipeline designed for analysis of read data obtained using these protocols. This analysis pipeline is built into the OnRamp webapp ( http://OnRamp.BoyleLab.org ), which generates alignments between actual and predicted plasmid sequences, quality scores, and read-level views in a user-friendly manner, precluding the need for programming experience in analyzing nanopore results. Here we describe the OnRamp protocols and pipeline, and demonstrate our ability to obtain full sequences from pooled plasmids while detecting sequence variation even in regions of high secondary structure, at less than half the cost of equivalent Sanger sequencing.

Abstract Mobile element insertions (MEIs) are highly repetitive genomic sequences that contribute to inter- and intra-individual genetic variation and can lead to genetic disorders. Targeted and whole-genome approaches using short-read sequencing have been developed to identify reference and non-reference MEIs; however, the read length hampers detection of these elements in complex genomic regions. Here, we pair Cas9 targeted nanopore sequencing with computational methodologies to capture active MEIs in human genomes. We demonstrate parallel enrichment for distinct classes of MEIs, averaging 44% of reads on targeted signals. We show an individual flow cell can recover a remarkable fraction of MEIs (97% L1Hs, 93% Alu Yb, 51% Alu Ya, 99% SVA_F, and 65% SVA_E). We identify twenty-one non-reference MEIs in GM12878 overlooked by modern, long-read analysis pipelines, primarily in repetitive genomic regions. This work introduces the utility of nanopore sequencing for MEI enrichment and lays the foundation for rapid discovery of elusive, repetitive genetic elements.

Abstract Oxford Nanopore sequencers provide results in real time as DNA passes through a nanopore and can eject a molecule after it has been partly sequenced. However, the computational challenge of deciding whether to keep or reject a molecule in real time has limited the application of this capability. We present SquiggleNet, the first deep learning model that can classify nanopore reads directly from their electrical signals. SquiggleNet operates faster than the DNA passes through the pore, allowing real-time classification and read ejection. When given the amount of sequencing data generated in one second, the classifier achieves significantly higher accuracy than base calling followed by sequence alignment. Our approach is also faster and requires an order of magnitude less memory than approaches based on alignment. SquiggleNet distinguished human from bacterial DNA with over 90% accuracy, generalized to unseen species, identified bacterial species in a human respiratory meta genome sample, and accurately classified sequences containing human long interspersed repeat elements.

Zebrafish have been a foundational model organism for studying the spatio-temporal activity of genes and their regulatory sequences. A variety of approaches are currently available for editing genes and modifying gene expression in zebrafish including RNAi, Cre/lox, and CRISPR-Cas9. However, the lac operator-repressor system, a component of the E. Coli lac operon, has been adapted for use in many other species to study the inducible modulation of gene expression, but has not previously been shown to function in zebrafish. Here we demonstrate that the lac operator-repressor system robustly decreases expression of firefly luciferase in cultured zebrafish fibroblast cells. Our work establishes the lac operator-repressor system as a promising tool for the manipulation of gene expression in whole zebrafish. Additionally we show the first evidence that the cytomegalovirus (CMV) enhancer is active in zebrafish cells and enhances eGFP expression ubiquitously in zebrafish embryos. Our results lay the groundwork for the development of lac -based reporter assays in zebrafish, and add to the tools available for investigating dynamic gene expression in embryogenesis. We believe that this work will catalyze the development of new reporter assay systems to investigate uncharacterized regulatory elements and their cell-type specific activities.