Abstract Introduction Vascular smooth muscle cells (VSMCs) play a pivotal role in vascular homeostasis, with dysregulation leading to vascular complications. Human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived VSMCs offer prospects for personalized disease modeling and regenerative strategies. Current research lacks comparative studies on the impact of 3D substrate properties under cyclic strain on phenotype adaptation in hiPSC-derived VSMCs. Here we investigated the potential of human mural cells derived from hiPSC-derived organoids (ODMCs) to undergo phenotypical adaptation under various biological and 3D mechanical stimuli. Methods and results ODMCs were cultured in 2D conditions with synthetic or contractile differentiation medium, or 3D Gelatin Methacryloyl (GelMa) substrates with varying degrees of functionalization and percentages to modulate material stiffness, elasticity, and crosslink density. Cells in 3D substrates were exposed to cyclic unidirectional strain. Phenotype characterization was conducted using specific markers through immunofluorescence and gene expression analysis. Under static 2D culture, ODMCs derived from hiPSCs exhibited a VSMC phenotype, expressing key mural markers, and demonstrated a level of phenotypic plasticity like primary human vSMCs. In static 3D culture, higher substrate stiffness, lower elasticity and higher crosslink density promoted a contractile phenotype in ODMCs and vSMCs. Dynamic stimulation in 3D substrate promoted a switch towards a contractile phenotype in both cell types. Conclusion Our study demonstrates a phenotypic plasticity of human ODMCs in response to 2D biological and 3D mechanical stimuli that equals that of primary human vSMCs. These findings may contribute to the advancement of tailored approaches for vascular disease modelling and regenerative strategies

Abstract Background Atherosclerosis is a complex inflammatory vascular disease characterized by lipid and immune cells accumulation in the vessel wall, leading to lumen narrowing. Although several 3D in vitro microfluidic systems were previously described, a realistic reconstruction of the in vivo human atherosclerotic environment requires co-culture of different cell types arranged in atherosclerotic vessel-like structures with exposure to flow and circulating cells, creating challenges for disease modelling. In this study we developed a 3D tubular microfluidic model with quadruple coculture of human aortic smooth muscle cells (hAoSMCs), human umbilical cord vein endothelial cells (HUVECs) and foam cells to re-create a complex human atherosclerotic vessel in vitro to study the effect of flow and circulating immune cells. Methods & Results Our new co-culture protocol with BFP-labelled hAoSMCs, GFP-labelled HUVECs and THP-1 macrophages-derived, Dil-labelled Oxidized Low-Density Lipoprotein (Dil-Ox-LDL) foam cells in a fibrinogen-collagen-I based 3D extracellular matrix (ECM) resulted in vessels with an early lesion morphology, showing a layered vessel-like composition with an endothelium and media, with foam cells accumulating in the sub-endothelial space. Perfusion for 24 hours of atherosclerotic and “healthy” vessels (BFP hAoSMCs and GFP HUVECs without foam cells) showed that the layered wall composition remained stable. Perfusion with circulating THP-1 monocytes demonstrated cell extravasation into the atherosclerotic vessel wall and recruitment of THP-1 cells to the foam cell core. QPCR analysis revealed increased expression of atherosclerosis markers in the atherosclerotic vessels and adaptation in VSMCs migration to flow and the plaque microenvironment, compared to control vessels. Conclusion We present a 3D tubular microfluidic model of a complex early atherosclerotic human vessel that can be exposed to flow and circulating THP-1 monocytes to study hemodynamic changes and immune cell recruitment under live confocal imaging. This novel atherosclerosis-on-a-chip model offers a humanized platform for in-depth mechanistic in vitro studies and drug testing.

Abstract Funding Acknowledgements Type of funding sources: Public grant(s) – National budget only. Main funding source(s): Dutch CardioVascular Alliance (an initiative with support of the Dutch Heart Foundation) Grant 2020B008 RECONNEXT, and the German Center for Cardiovascular Research (DZHK; 81Z0600207) Background Heart failure with preserved ejection fraction lacks targeted therapies, due to insufficient understanding of pathogenesis. A multiple comorbidity swine model (MCS) was developed by exposure to three risk factors for six months including diabetes (streptozotocin), chronic kidney disease (renal embolization), and an unhealthy diet (high-fat, high salt diet). An additional risk factor ovariectomy was added on top of the MCS model (MCS+). MCS and MCS+ presented with left ventricular diastolic dysfunction, oxidative stress, coronary microvascular dysfunction and inflammation. Furthermore, myocardial oxygen consumption was increased given the same level of cardiac work (Fig. A), suggesting an impairment in myocardial mitochondrial function. Using a combined-omics approach, the purpose of this study is to unravel alterations in gene expression and proteome abundance regarding mitochondrial function in MCS swine. Methods 15 MCS, 4 MCS+ and 10 healthy control female swine were included in the study. Proteome analysis and single nuclei RNA sequencing, were performed on frozen MCS left ventricle myocardial samples. Cardiac mitochondrial function was measured by an O2k-FlouRespirometer ex vivo in MCS+ swine versus control. Results Proteome analysis showed a reduced abundance of proteins involved in branched-chain amino acid (BCAA) catabolism (Fig. B). Single nuclei RNA sequencing of a subgroup of the same animals demonstrated a downregulation of these genes specifically in cardiomyocyte subpopulations. BCAA can act as a source of ATP via oxidative phosphorylation and can modulate mitochondrial substrate utilisation, and impair mitochondrial function, resulting in increased mitochondrial production of reactive oxygen species (ROS). Mitochondrial function was measured in fresh myocardial tissue, using pyruvate/malate/glutamate as substrate. Low mitochondrial respiratory sensitivity to ADP was observed 26±2.5 in MCS+ vs 43.6±1.5 pmol/(s*mg tissue) in healthy control, reflecting low oxidative capacity. Moreover, the respiratory rate after uncoupling by FCCP was reduced in MCS+ versus healthy control (73.6±11.7 vs 118.4±15.6 pmol/(s*mg tissue). These findings are consistent with our data in the MCS swine and indicate impaired BCAA in the myocardium of animals with comorbidities, which is associated with increased ROS levels (8-isoprostane 12.9±0.8 pg/mg protein in MCS vs 10.3±0.5 in healthy animals) and impaired myocardial efficiency during exercise (Fig. A). Conclusion A combined omics approach suggested an alteration in cardiac mitochondria. Respiratory analyses showed impaired mitochondrial bioenergetics and increased oxidative stress, which can contribute to diastolic dysfunction.