Protein kinase B (PKB) is a proto-oncogene that is activated in signaling pathways initiated by phosphoinositide 3-kinase. Chromatographic separation of brain cytosol revealed a kinase activity that phosphorylated and activated PKB only in the presence of phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate [PtdIns(3,4,5)P 3 ]. Phosphorylation occurred exclusively on threonine-308, a residue implicated in activation of PKB in vivo. PtdIns(3,4,5)P 3 was determined to have a dual role: Its binding to the pleckstrin homology domain of PKB was required to allow phosphorylation by the upstream kinase and it directly activated the upstream kinase.

The specific phosphoinositide 3-kinase (PI3K) inhibitors wortmannin and LY294002 have been invaluable tools for elucidating the roles of these enzymes in signal transduction pathways. The X-ray crystallographic structures of PI3Kγ bound to these lipid kinase inhibitors and to the broad-spectrum protein kinase inhibitors quercetin, myricetin, and staurosporine reveal how these compounds fit into the ATP binding pocket. With a nanomolar IC50, wortmannin most closely fits and fills the active site and induces a conformational change in the catalytic domain. Surprisingly, LY294002 and the lead compound on which it was designed, quercetin, as well as the closely related flavonoid myricetin bind PI3K in remarkably different orientations that are related to each other by 180° rotations. Staurosporine/PI3K interactions are reminiscent of low-affinity protein kinase/staurosporine complexes. These results provide a rich basis for development of isoform-specific PI3K inhibitors with therapeutic potential.

Protein kinase B (PKB) is activated in response to phosphoinositide 3-kinases and their lipid products phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate [PtdIns(3,4,5)P 3 ] and PtdIns(3,4)P 2 in the signaling pathways used by a wide variety of growth factors, antigens, and inflammatory stimuli. PKB is a direct target of these lipids, but this regulation is complex. The lipids can bind to the pleckstrin homologous domain of PKB, causing its translocation to the membrane, and also enable upstream, Thr 308 -directed kinases to phosphorylate and activate PKB. Four isoforms of these PKB kinases were purified from sheep brain. They bound PtdIns(3,4,5)P 3 and associated with lipid vesicles containing it. These kinases contain an NH 2 -terminal catalytic domain and a COOH-terminal pleckstrin homologous domain, and their heterologous expression augments receptor activation of PKB, which suggests they are the primary signal transducers that enable PtdIns(3,4,5)P 3 or PtdIns- (3,4)P 2 to activate PKB and hence to control signaling pathways regulating cell survival, glucose uptake, and glycogen metabolism.

Phosphoinositide 3 kinase (PI3K) is a key signaling enzyme implicated in receptor-stimulated mitogenesis, oxidative bursting in neutrophils, membrane ruffling, and glucose uptake. A PI3K has already been purified, cloned, and shown to be regulated by receptors that act via tyrosine kinase-dependent regulatory mechanisms. We report that an immunologically, pharmacologically, and chromatographically distinct form of PI3K activity present in neutrophils and U937 cells is specifically activated by G protein βγ subunits. This data suggests PI3Ks conform to the paradigm set by receptor regulation of phosphoinositidase Cs: different receptor transduction systems specifically regulate dedicated isoforms of effector protein.

Ras activation of phosphoinositide 3-kinase (PI3K) is important for survival of transformed cells. We find that PI3Kgamma is strongly and directly activated by H-Ras G12V in vivo or by GTPgammaS-loaded H-Ras in vitro. We have determined a crystal structure of a PI3Kgamma/Ras.GMPPNP complex. A critical loop in the Ras binding domain positions Ras so that it uses its switch I and switch II regions to bind PI3Kgamma. Mutagenesis shows that interactions with both regions are essential for binding PI3Kgamma. Ras also forms a direct contact with the PI3Kgamma catalytic domain. These unique Ras/PI3Kgamma interactions are likely to be shared by PI3Kalpha. The complex with Ras shows a change in the PI3K conformation that may represent an allosteric component of Ras activation.

Abstract

 Two highly similar, PtdIns(4,5)P₂-selective, Gβγ-activated PI3Ks were purified from pig neutrophil cytosol. Both were heterodimers, were composed of a 101 kDa protein and either a 120 kDa or a 117 kDa catalytic subunit, and were activated greater than 100-fold by Gβγs. Peptide sequence–based oligonucleotide probes were used to clone cDNAs for the p120 and p101 species. The cDNA of p120 is highly related to p110γ, while the cDNA of p101 is not substantially related to anything in current databases. The proteins were expressed in and purified from insect and mammalian cells. They bound tightly to one another, both in vivo and in vitro, and in so doing, p101 amplified the effect of Gβγs on the PI3K activity of p120 from less than 2-fold to greater than 100-fold.

Answers from Exomes Exome sequencing, which targets only the protein-coding regions of the genome, has the potential to identify the underlying genetic causes of rare inherited diseases. Angulo et al. (p. 866 , published online 17 October; see Perspective by Conley and Fruman ) performed exome sequencing of individuals from seven unrelated families with severe, recurrent respiratory infections. The patients carried the same mutation in the gene coding for the catalytic subunit of phosphoinositide 3-kinase δ (PI3Kδ). The mutation caused aberrant activation of this kinase, which plays a key role in immune cell signaling. Drugs inhibiting PI3Kδ are already in clinical trials for other disorders.

Background: Phosphoinositide 3-kinases (PI 3-kinases) are thought to play an important role in coordinating the responses elicited by a variety of growth factors, oncogene products and inflammatory stimuli. These responses include activation of membrane ruffling, chemotaxis, glucose transport, superoxide production, neurite outgrowth and pp70 S6 kinase. Some of these responses are also known to be regulated by Rac, a small GTP-binding protein related to Ras. Neither the transducing elements upstream of Rac, nor those downstream of PI 3-kinase, have been defined.Results We show here that platelet-derived growth factor (PDGF) can stimulate an increase in the level of GTP–Rac by at least two distinct mechanisms: firstly, by increased guanine nucleotide exchange; and secondly, by inhibition of a Rac GTPase activity. The first of these mechanisms is essential for the activation of Rac, and we show that it is dependent upon PDGF-stimulated synthesis of phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate.Conclusion These results suggest that Rac activation lies downstream of PI 3-kinase activation on a PDGF-stimulated signalling pathway. Furthermore, as Rac has been implicated in at least two diverse cellular responses that are also thought to require activation of PI 3-kinase — a reorganization of the actin cytoskeleton known as membrane ruffling and the neutrophil oxidative burst — these results suggest that Rac may be a major effector protein for the PI 3-kinase signalling pathway in many cell types.