A rapid and sensitive method is crucial for nucleic acid detection. Recently, RNA-guided CRISPR/Cas12a nuclease-based methods present great promise for nucleic acid detection. In the present methods, however, DNA amplification and subsequent Cas12a cleavage is separated and the whole process takes as long as 2 h. Most importantly, the uncapping operation increases the risk of aerosol contamination. In this study, we propose a CRISPR/Cas12a-based method named "Cas12aVDet" for rapid nucleic acid detection. By integrating recombinase polymerase amplification (RPA) with Cas12a cleavage in a single reaction system, the detection can be accomplished in 30 min and uncapping contamination can be avoided. The detection signal can be observed by the naked eye under blue light. This method could detect DNA at single molecule level and demonstrated 100% accuracy for mycoplasma contamination detection, presenting great potential for a variety of nucleic acid detection applications.

The cell intrinsic factors that determine whether a neuron regenerates or undergoes apoptosis in response to axonal injury are not well defined. Here we show that the mixed-lineage dual leucine zipper kinase (DLK) is an essential upstream mediator of both of these divergent outcomes in the same cell type. Optic nerve crush injury leads to rapid elevation of DLK protein, first in the axons of retinal ganglion cells (RGCs) and then in their cell bodies. DLK is required for the majority of gene expression changes in RGCs initiated by injury, including induction of both proapoptotic and regeneration-associated genes. Deletion of DLK in retina results in robust and sustained protection of RGCs from degeneration after optic nerve injury. Despite this improved survival, the number of axons that regrow beyond the injury site is substantially reduced, even when the tumor suppressor phosphatase and tensin homolog (PTEN) is deleted to enhance intrinsic growth potential. These findings demonstrate that these seemingly contradictory responses to injury are mechanistically coupled through a DLK-based damage detection mechanism.

ABSTRACT Phagocytic clearance of degenerating neurons is triggered by “eat-me” signals exposed on the neuronal surface. The conserved neuronal eat-me signal phosphatidylserine (PS) and the engulfment receptor Draper (Drpr) mediate phagocytosis of degenerating neurons in Drosophila . However, how PS is recognized by Drpr-expressing phagocytes in vivo remains poorly understood. Using multiple models of dendrite degeneration, we show that the Drosophila chemokine-like protein Orion can bind to PS and is responsible for detecting PS exposure on neurons; it is supplied cell-non-autonomously to coat PS-exposing dendrites and to mediate interactions between PS and Drpr, thus enabling phagocytosis. As a result, the accumulation of Orion on neurons and on phagocytes produces opposite outcomes by potentiating and suppressing phagocytosis, respectively. Moreover, the Orion dosage is a key determinant of the sensitivity of phagocytes to PS exposed on neurons. Lastly, mutagenesis analyses show that the sequence motifs shared between Orion and human immunomodulatory proteins are important for Orion function. Thus, our results uncover a missing link in PS-mediated phagocytosis in Drosophila and imply conserved mechanisms of phagocytosis of neurons. SIGNIFICANCE STATEMENT Phagocytes efficiently clear sick or damaged neuronal branches by engulfing them, while leaving healthy branches untouched. How phagocytes recognize degenerating neurites remains poorly understood. Here, we identified a key role for the secreted protein Orion in the detection and engulfment of degenerating neurites in Drosophila . Using multiple models of dendrite degeneration, we found that Orion acts as a bridging molecule between the neuronal “eat-me” signal phosphatidylserine and the engulfment receptor Draper on phagocytes, enabling phagocytosis. Our study reveals a missing link in phosphatidylserine-mediated phagocytosis in vivo , sheds light on factors determining the sensitivity of phagocytes, and implies the potential for manipulating the detection of neuronal “eat-me” signals in neurodegenerative diseases.

ABSTRACT After injury, severed dendrites and axons expose the “eat-me” signal phosphatidylserine (PS) on their surface and degenerate by disassembly. While axon degeneration is controlled by a conserved “axon-death” pathway that is thought to activate self-destruction, how PS exposure is regulated by this pathway and whether PS-induced phagocytosis contributes to neurite breakdown in vivo remain unknown. Here we show that in Drosophila sensory dendrites, PS exposure and self-destruction are triggered by two distinct levels of NAD + reduction downstream of Sarm activation. Surprisingly, phagocytosis is the main driver of dendrite degeneration induced by both genetic NAD + disruptions and injury. Furthermore, the axon-death factor Axed is only partially required for self-destruction of injured dendrites, acting in parallel with PS-induced phagocytosis. Lastly, injured dendrites exhibit a unique rhythmic calcium flashing that correlates with self-destruction. Therefore, a special genetic program coordinates PS exposure and self-destruction in injury-induced dendrite degeneration in vivo .

SUMMARY Lipid homeostasis is critical to the survival of neurons. Lipid transporters from the ATP-binding cassette A (ABCA) subfamily are important regulators of lipid trafficking and are associated with multiple neurodegenerative diseases. How ABCA transporters regulate specific aspects of lipid homeostasis to impact neurodegeneration is an outstanding question. Here we report that the Drosophila ABCA protein Engulfment ABC Transporter in the ovary (Eato) contributes to phagocytosis-dependent neurodegeneration by playing two opposing roles in neurons and nearby phagocytes: In neurons, Eato prevents dendrites and axons from being attacked and engulfed by neighboring phagocytes; in phagocytes, however, Eato enhances the ability of these cells to detect neurons as engulfment targets. Thus, Eato deficiency in neurons alone results in severe phagocytosis-dependent dendrite and axon degeneration, whereas removing Eato from both neurons and phagocytes completely rescues the neurite degeneration. Surprisingly, Eato exerts its functions in both neurons and phagocytes by suppressing the effects of the eat-me signal phosphatidylserine (PS) exposed on the cell surface. Interestingly, multiple human and C. elegans ABCA homologs can compensate for the loss of Eato in phagocytes but not in neurons, suggesting both conserved and cell type-specific activities of these ABCA proteins. These results reveal how ABCA proteins participate in neurodegeneration by regulating PS homeostasis and imply possible mechanisms of neuron-phagocyte interactions in neurodegenerative diseases.

Abstract Sensory neurons enable an organism to perceive external stimuli, which is essential for survival. The sensory capacity of a neuron depends on the elaboration of its dendritic arbor and the delivery of sensory ion channels to the dendritic membrane. However, it is not well understood how ion channels are trafficked to sensory dendrites and whether their delivery is coordinated with dendrite growth. We investigated the trafficking of the DEG/ENaC/ASIC ion channel Pickpocket (Ppk) in peripheral sensory neurons in fruit fly larvae. We used CRISPR-Cas9 genome engineering to tag endogenous Ppk1 and visualize it live, including monitoring Ppk1 membrane localization via a novel secreted split-GFP approach. Strikingly, Ppk1 is present throughout the membrane of actively growing dendrites, and Ppk1 density scales in proportion to the dendritic membrane, even when dynein-mediated transport to dendrites is disrupted. Our data suggest that Ppk1 is integral to the membrane of growing dendrites and implicate the recycling endosome GTPase Rab11 in the forward trafficking of Ppk1 to dendrites. Together, our results suggest that Ppk channel transport is coordinated with dendrite morphogenesis, thus ensuring proper ion channel levels and distribution in sensory dendrites. Author Summary Peripheral sensory neurons are essential for an organism to interact with its environment. Neurons are composed of signal-receiving dendrites and a signal-sending axon. Ion channels distributed throughout sensory dendrites transduce external stimuli into chemical signals, however the mechanisms that localize ion channels to sensory dendrites are not well understood. Both the composition of ion channels in the dendrites and the structure of a sensory neuron’s dendritic arbor are important for how it functions to sense external stimuli. Using live imaging and genomic engineering, we have discovered that the localization of a sensory ion channel, Pickpocket, in fruit fly sensory neurons is coordinated with growth of the dendritic arbor and that Pickpocket levels scale in proportion to dendrite length, even when transport to dendrites is disrupted. We also developed a novel genetically encoded approach to visualize the membrane expression of proteins in a living organism utilizing the split-GFP system. We found that both the secretory and endosomal networks mediate the forward trafficking of Pickpocket during neuronal morphogenesis, thus coordinating membrane growth with ion channel delivery. Our findings reveal that actively growing sensory dendrites are equipped with the ion channels needed for sensing external stimuli.

Abstract Drosophila has been a powerful model system for biological studies due to the wide range of genetic tools established for it. Among these tools, Gal4 is the most abundant, offering unparalleled tissue- and developmental stage-specificity for gene manipulation. In comparison, other genetic reagents are far fewer in choices. Here we present a genetic toolkit for converting Gal4 strains into LexA and Flippase transgenes through simple genetic crosses and fluorescence screening. We demonstrate the proof-of-principle by converting ten Gal4 lines that exhibit diverse tissue specificities and examined the activity patterns of the converted LexA and Flippase lines. Gal4-to-LexA and Flp conversion is fast and convenient and should greatly expand the choices of LexA and Flp for binary expression and FRT-based mosaic analysis, respectively, in Drosophila .

Abstract Mosaic animals have provided the platform for many fundamental discoveries in developmental biology, cell biology, and other fields. Techniques to produce mosaic animals by mitotic recombination have been extensively developed in Drosophila melanogaster but are less common for other laboratory organisms. Here, we report m osaic a nalysis by g RNA- i nduced c rossing-over (MAGIC), a new technique for generating mosaic animals based on DNA double-strand breaks produced by CRISPR/Cas9. MAGIC efficiently produces mosaic clones in both somatic tissues and the germline of Drosophila . Further, by developing a MAGIC toolkit for one chromosome arm, we demonstrate the method’s application in characterizing gene function in neural development and in generating fluorescently marked clones in wild-derived Drosophila strains. Eliminating the need to introduce recombinase-recognition sites in the genome, this simple and versatile system simplifies mosaic analysis in Drosophila and can be applied in any organism that is compatible with CRISPR/Cas9.

ABSTRACT CRISPR/Cas9 has emerged as a powerful technology for tissue-specific mutagenesis. However, tissue-specific CRISPR/Cas9 tools currently available in Drosophila remain deficient in three significant ways. First, many existing gRNAs are inefficient, such that further improvements of gRNA expression constructs are needed for more efficient and predictable mutagenesis in both somatic and germline tissues. Second, it has been difficult to label mutant cells in target tissues with current methods. Lastly, application of tissue-specific mutagenesis at present often relies on Gal4-driven Cas9, which hampers the flexibility and effectiveness of the system. Here we tackle these deficiencies by building upon our previous CRISPR-mediated tissue restricted mutagenesis (CRISPR-TRiM) tools. First, we significantly improved gRNA efficiency in somatic tissues by optimizing multiplexed gRNA design. Similarly, we also designed efficient dual-gRNA vectors for the germline. Second, we developed methods to positively and negatively label mutant cells in tissue-specific mutagenesis by incorporating co-CRISPR reporters into gRNA expression vectors. Lastly, we generated genetic reagents for convenient conversion of existing Gal4 drivers into tissue-specific Cas9 lines based on homology-assisted CRISPR knock-in (HACK). In this way, we expand the choices of Cas9 for CRISPR-TRiM analysis to broader tissues and developmental stages. Overall, our upgraded CRISPR/Cas9 tools make tissue-specific mutagenesis more versatile, reliable, and effective in Drosophila . These improvements may be also applied to other model systems.

Animal development involves numerous molecular events, whose spatiotemporal properties largely determine the biological outcomes. Conventional methods for studying gene function lack the necessary spatiotemporal resolution for precise dissection of developmental mechanisms. Optogenetic approaches are powerful alternatives, but most existing tools rely on exogenous designer proteins that produce narrow outputs and cannot be applied to diverse or endogenous proteins. To address this limitation, we developed OptoTrap, a light-inducible protein trapping system that allows manipulation of endogenous proteins tagged with GFP or split GFP. This system turns on fast and is reversible in minutes or hours. We generated OptoTrap variants optimized for neurons and epithelial cells and demonstrate effective trapping of endogenous proteins of diverse sizes, subcellular locations, and functions. Furthermore, OptoTrap allowed us to instantly disrupt microtubules and inhibit the kinesin-1 motor in specific dendritic branches of Drosophila sensory neurons. Using OptoTrap, we obtained direct evidence that microtubules support the growth of highly dynamic dendrites. Similarly, targeted manipulation of Kinesin heavy chain revealed differential spatiotemporal requirements of kinesin-1 in the patterning of low- and high-order dendritic branches, suggesting that different cargos are needed for the growth of these branches. OptoTrap allows for precise manipulation of endogenous proteins in a spatiotemporal manner and thus holds great promise for studying developmental mechanisms in a wide range of cell types and developmental stages.