Abstract DNA polymerase ε (pol ε) participates in the leading DNA strand synthesis in eukaryotes. The catalytic subunit of this enzyme, Pol2, is a fusion of two ancestral B-family DNA polymerases. Paradoxically, the catalytically active N-terminal pol is dispensable, and an inactive C-terminal pol is essential for yeast cell viability. Despite extensive studies of strains without the active N-terminal half (mutation pol2-16 ), it is still unclear how they survive and what is the mechanism of rapid recovery of initially miserably growing cells. The reason for the slow progress is in the difficultly of obtaining strains with the defect. We designed a robust method for constructing mutants with only the C-terminal part of Pol2 using allele pol2rc-ΔN with optimized codon usage. Colonies bearing pol2rc-ΔN appear three times sooner than colonies of pol2-16 but exhibit similar growth defects: sensitivity to hydroxyurea, chromosomal instability, and an elevated level of spontaneous mutagenesis. UV-induced mutagenesis is partially affected; it is lower only at high doses in some reporters. The analysis of the genomes of pol2rc-ΔN isolates revealed the prevalence of nonsynonymous mutations suggesting that the growth recovery was a result of positive selection for better growth fueled by variants produced by the elevated mutation rate. Mutations in the CDC28 gene, the primary regulator of the cell cycle, were repeatedly found in independent clones. Genetic analysis established that cdc28 alleles single-handedly improve the growth of pol2rc-ΔN strains and suppress sensitivity hydroxyurea. The affected amino acids are located on the Cdc28 molecule’s two surfaces that mediate contacts with cyclins or kinase subunits. Our work establishes the significance of the CDC28 gene for the resilience of replication and predicts that changes in mammalian homologs of cyclin-dependent kinases may play a role in remastering replication to compensate for the defects in the leading strand synthesis by the dedicated polymerase. Author Summary The catalytic subunit of the leading strand DNA polymerase ε, Pol2, consists of two halves made of two different ancestral B-family DNA polymerases. Counterintuitively, the catalytically active N-terminal half is dispensable while the inactive C-terminal part is required for viability. The corresponding strains show a severe growth defect, sensitivity to replication inhibitors, chromosomal instability, and elevated spontaneous mutagenesis. Intriguingly, the slow-growing mutant strains rapidly produced fast-growing clones. We discovered that the adaptation to the loss of the catalytic N-terminal part of Pol2 occurs during evolution by positive selection for a better growth fueled by variants produced by elevated mutation rates. Mutations in the cell cycle-dependent kinase gene, CDC28 , can single-handedly improve the growth of strains lacking the N-terminal part of Pol2. Our study predicts that changes in mammalian homologs of cyclin-dependent kinases may play a role in response to the defects of active leading strand polymerase.

Dynamic hydrogels are emerging as advanced materials for engineering tissue-like environments that mimic cellular microenvironments. We introduce a diselenide-cross-linked hydrogel system with light-responsive properties, designed for precise control of tumor organoid growth and light-initiated radical inactivation, particularly for dendritic cell (DC) vaccines. Diselenide exchange enables stress relaxation and hydrogel remodeling, while recombination and quenching of seleno radicals (Se•) reduce cross-linking density, leading to controlled degradation. We demonstrate a 2D to 3D growth strategy, where tumor cells inoculate on the hydrogel surface, expand, and gradually form spherical organoids within the 3D hydrogel. These tumor organoids show significantly higher drug resistance compared to 2D-cultured cells. High-density light irradiation enhances diselenide exchange, inducing hydrogel degradation, tumor cell death, and release of functional antigens. This system serves as a dynamic platform for tumor organoid culture and antigen release, offering significantly advanced approaches for in vitro tumor modeling and immunological research. Our findings position diselenide-cross-linked hydrogels as versatile materials for precision cellular engineering, with broad applications in cancer research and beyond.

Abstract The koala ( Phascolarctos cinereus ) is an iconic Australian species that is listed as endangered in the northern parts of its range due to loss of habitat, disease, and road deaths. Diseases contribute significantly to the decline of koala populations, primarily Chlamydia and koala retrovirus. The distribution of these diseases across the species’ range, however, is not even. Toll-like receptors (TLRs) play a crucial role in innate immunity by recognising and responding to various pathogens. Variations in TLR genes can influence an individual’s susceptibility or resistance to infectious diseases. The aim of this study was to identify koala TLR diversity across the east coast of Australia using 413 re-sequenced genomes at 30 × coverage. We identified 45 single-nucleotide polymorphisms (SNP) leading to 51 alleles within ten TLR genes. Our results show that the diversity of TLR genes in the koala forms four distinct genetic groups, which are consistent with the diversity of the koala major histocompatibility complex (MHC), another key immune gene family. The bioinformatics approach presented here has broad applicability to other threatened species with existing genomic resources.