Abstract Objective To investigate whether smoking and HLA–DR shared epitope (SE) genes may interact in triggering immune reactions to citrulline‐modified proteins. Methods In a case–control study involving patients with recent‐onset rheumatoid arthritis (RA), we studied interactions between a major environmental risk factor (smoking), major susceptibility genes included in the SE of HLA–DR, and the presence of the most specific autoimmunity known for RA (i.e., antibodies to proteins modified by citrullination). Immunostaining for citrullinated proteins in cells from bronchoalveolar lavage fluid was used to investigate whether smoking is associated with citrullination in the lungs. Results Previous smoking was dose‐dependently associated with occurrence of anticitrulline antibodies in RA patients. The presence of SE genes was a risk factor only for anticitrulline‐positive RA, and not for anticitrulline‐negative RA. A major gene–environment interaction between smoking and HLA–DR SE genes was evident for anticitrulline‐positive RA, but not for anticitrulline‐negative RA, and the combination of smoking history and the presence of double copies of HLA–DR SE genes increased the risk for RA 21‐fold compared with the risk among nonsmokers carrying no SE genes. Positive immunostaining for citrullinated proteins was recorded in bronchoalveolar lavage cells from smokers but not in those from nonsmokers. Conclusion We identified an environmental factor, smoking, that in the context of HLA–DR SE genes may trigger RA‐specific immune reactions to citrullinated proteins. These data thus suggest an etiology involving a specific genotype, an environmental provocation, and the induction of specific autoimmunity, all restricted to a distinct subset of RA.

Gene-gene and gene-environment interactions are key features in the development of rheumatoid arthritis (RA) and other complex diseases. The aim of this study was to use and compare three different definitions of interaction between the two major genetic risk factors of RA—the HLA-DRB1 shared epitope (SE) alleles and the PTPN22 R620W allele—in three large case-control studies: the Swedish Epidemiological Investigation of Rheumatoid Arthritis (EIRA) study, the North American RA Consortium (NARAC) study, and the Dutch Leiden Early Arthritis Clinic study (in total, 1,977 cases and 2,405 controls). The EIRA study was also used to analyze interactions between smoking and the two genes. “Interaction” was defined either as a departure from additivity, as interaction in a multiplicative model, or in terms of linkage disequilibrium—for example, deviation from independence of penetrance of two unlinked loci. Consistent interaction, defined as departure from additivity, between HLA-DRB1 SE alleles and the A allele of PTPN22 R620W was seen in all three studies regarding anti-CCP–positive RA. Testing for multiplicative interactions demonstrated an interaction between the two genes only when the three studies were pooled. The linkage disequilibrium approach indicated a gene-gene interaction in EIRA and NARAC, as well as in the pooled analysis. No interaction was seen between smoking and PTPN22 R620W. A new pattern of interactions is described between the two major known genetic risk factors and the major environmental risk factor concerning the risk of developing anti-CCP–positive RA. The data extend the basis for a pathogenetic hypothesis for RA involving genetic and environmental factors. The study also raises and illustrates principal questions concerning ways to define interactions in complex diseases. Gene-gene and gene-environment interactions are key features in the development of rheumatoid arthritis (RA) and other complex diseases. The aim of this study was to use and compare three different definitions of interaction between the two major genetic risk factors of RA—the HLA-DRB1 shared epitope (SE) alleles and the PTPN22 R620W allele—in three large case-control studies: the Swedish Epidemiological Investigation of Rheumatoid Arthritis (EIRA) study, the North American RA Consortium (NARAC) study, and the Dutch Leiden Early Arthritis Clinic study (in total, 1,977 cases and 2,405 controls). The EIRA study was also used to analyze interactions between smoking and the two genes. “Interaction” was defined either as a departure from additivity, as interaction in a multiplicative model, or in terms of linkage disequilibrium—for example, deviation from independence of penetrance of two unlinked loci. Consistent interaction, defined as departure from additivity, between HLA-DRB1 SE alleles and the A allele of PTPN22 R620W was seen in all three studies regarding anti-CCP–positive RA. Testing for multiplicative interactions demonstrated an interaction between the two genes only when the three studies were pooled. The linkage disequilibrium approach indicated a gene-gene interaction in EIRA and NARAC, as well as in the pooled analysis. No interaction was seen between smoking and PTPN22 R620W. A new pattern of interactions is described between the two major known genetic risk factors and the major environmental risk factor concerning the risk of developing anti-CCP–positive RA. The data extend the basis for a pathogenetic hypothesis for RA involving genetic and environmental factors. The study also raises and illustrates principal questions concerning ways to define interactions in complex diseases. Rheumatoid arthritis (RA [MIM 180300]) is a prototype of an autoimmune disease with complex etiology that is assumed to involve several genetic as well as environmental factors. The clinical hallmark of RA is symmetrical inflammatory arthritis. The disease is more common among women than men. The major risk factors that have so far been reproducibly identified are genetic variations in the major histocompatibility complex, class II, DR beta 1 (HLA-DRB1 [MIM 142857]) and protein tyrosine phosphatase (PTPN22 [MIM 600716])1Gregersen PK Silver J Winchester RJ The shared epitope hypothesis.Arthritis Rheum. 1987; 30: 1205-1213Crossref PubMed Scopus (1983) Google Scholar, 2Huizinga TWJ Amos CI van der Helm-van Mil AHM Chen W van Gaalen FA Jawaheer D Schreuder GMT Wener M Breedvald FC Ahmad N et al.Refining the complex rheumatoid arthritis phenotype based on specificity of the HLA-DRB1 shared epitope for antibodies to citrullinated proteins.Arthritis Rheum. 2005; 52: 3433-3438Crossref PubMed Scopus (438) Google Scholar, 3Plenge RM Padyukov L Remmers EF Purcell S Lee AT Karlson EW Wolfe F Kastner DL Alfredsson L Altshuler D et al.Replication of putative candidate-gene associations with rheumatoid arthritis in >4,000 samples from North America and Sweden: association of susceptibility with PTPN22, CTLA4, and PADI4.Am J Hum Genet. 2005; 77: 1044-1060Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (427) Google Scholar, 4Begovich AB Carlton VE Honigberg LA Schrodi SJ Chokkalingam AP Alexander HC Ardlie KG Huang Q Smith AM Spoerke JM et al.A missense single-nucleotide polymorphism in a gene encoding a protein tyrosine phosphatase (PTPN22) is associated with rheumatoid arthritis.Am J Hum Genet. 2004; 75: 330-337Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1120) Google Scholar genes and one environmental risk factor, smoking.5Stolt P Bengtsson C Nordmark B Lindblad S Lundberg I Klareskog L Alfredsson L Quantification of the influence of cigarette smoking on rheumatoid arthritis: results from a population based case-control study, using incident cases.Ann Rheum Dis. 2003; 62: 835-841Crossref PubMed Scopus (460) Google Scholar, 6Padyukov L Silva C Stolt P Alfredsson L Klareskog L A gene-environment interaction between smoking and shared epitope genes in HLA-DR provides a high risk of seropositive rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum. 2004; 50: 3085-3092Crossref PubMed Scopus (484) Google Scholar, 7Klareskog L Stolt P Lundberg K Källberg H Bengtsson C Grunewald J Ronnelid J Harris HE Ulfgren AK Rantapaa-Dahlqvist S et al.A new model for an etiology of RA: smoking may trigger HLA-DR (SE)-restricted immune reactions to autoantigens modified by citrullination.Arthritis Rheum. 2006; 54: 38-46Crossref PubMed Scopus (1030) Google Scholar, 8Linn-Rasker SP van der Helm-van Mil AH Van Gaalen FA Kloppenburg M de Vries R le Cessie S Breedveld FC Toes RE Huizinga TW Smoking is a risk factor for anti-CCP antibodies only in rheumatoid arthritis patients that carry HLA-DRB1 shared epitope alleles.Ann Rheum Dis. 2006; 65: 366-371Crossref PubMed Scopus (234) Google Scholar With regard to all three risk factors, the major effects have been seen in one subset of RA, characterized by the presence of antibodies to citrullinated proteins (anti-CCP), but not in the subset of RA in which these antibodies are not detected.2Huizinga TWJ Amos CI van der Helm-van Mil AHM Chen W van Gaalen FA Jawaheer D Schreuder GMT Wener M Breedvald FC Ahmad N et al.Refining the complex rheumatoid arthritis phenotype based on specificity of the HLA-DRB1 shared epitope for antibodies to citrullinated proteins.Arthritis Rheum. 2005; 52: 3433-3438Crossref PubMed Scopus (438) Google Scholar, 3Plenge RM Padyukov L Remmers EF Purcell S Lee AT Karlson EW Wolfe F Kastner DL Alfredsson L Altshuler D et al.Replication of putative candidate-gene associations with rheumatoid arthritis in >4,000 samples from North America and Sweden: association of susceptibility with PTPN22, CTLA4, and PADI4.Am J Hum Genet. 2005; 77: 1044-1060Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (427) Google Scholar, 7Klareskog L Stolt P Lundberg K Källberg H Bengtsson C Grunewald J Ronnelid J Harris HE Ulfgren AK Rantapaa-Dahlqvist S et al.A new model for an etiology of RA: smoking may trigger HLA-DR (SE)-restricted immune reactions to autoantigens modified by citrullination.Arthritis Rheum. 2006; 54: 38-46Crossref PubMed Scopus (1030) Google Scholar, 8Linn-Rasker SP van der Helm-van Mil AH Van Gaalen FA Kloppenburg M de Vries R le Cessie S Breedveld FC Toes RE Huizinga TW Smoking is a risk factor for anti-CCP antibodies only in rheumatoid arthritis patients that carry HLA-DRB1 shared epitope alleles.Ann Rheum Dis. 2006; 65: 366-371Crossref PubMed Scopus (234) Google Scholar Recently, a pronounced gene-environment interaction was identified between smoking and HLA-DRB1 shared epitope (SE) alleles.6Padyukov L Silva C Stolt P Alfredsson L Klareskog L A gene-environment interaction between smoking and shared epitope genes in HLA-DR provides a high risk of seropositive rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum. 2004; 50: 3085-3092Crossref PubMed Scopus (484) Google Scholar, 7Klareskog L Stolt P Lundberg K Källberg H Bengtsson C Grunewald J Ronnelid J Harris HE Ulfgren AK Rantapaa-Dahlqvist S et al.A new model for an etiology of RA: smoking may trigger HLA-DR (SE)-restricted immune reactions to autoantigens modified by citrullination.Arthritis Rheum. 2006; 54: 38-46Crossref PubMed Scopus (1030) Google Scholar, 8Linn-Rasker SP van der Helm-van Mil AH Van Gaalen FA Kloppenburg M de Vries R le Cessie S Breedveld FC Toes RE Huizinga TW Smoking is a risk factor for anti-CCP antibodies only in rheumatoid arthritis patients that carry HLA-DRB1 shared epitope alleles.Ann Rheum Dis. 2006; 65: 366-371Crossref PubMed Scopus (234) Google Scholar The demonstration of this gene-environment interaction, together with immunological studies in animal models of arthritis, led us to form a new etiologic hypothesis suggesting that smoking contributes to citrullination and to triggering of anti-citrulline immunity, which is restricted by HLA-DRB1 SE alleles.7Klareskog L Stolt P Lundberg K Källberg H Bengtsson C Grunewald J Ronnelid J Harris HE Ulfgren AK Rantapaa-Dahlqvist S et al.A new model for an etiology of RA: smoking may trigger HLA-DR (SE)-restricted immune reactions to autoantigens modified by citrullination.Arthritis Rheum. 2006; 54: 38-46Crossref PubMed Scopus (1030) Google Scholar, 9Lundberg K Nijenhuis S Vossenaar E Palmblad K van Venrooij WJ Klareskog L Zendman AJ Harris HE Citrullinated proteins have increased immunogenicity and arthritogenicity and their presence in arthritic joints correlates with disease severity.Arthritis Res Ther. 2005; 7: R458-R467Crossref PubMed Google Scholar Since the PTPN22 gene codes for a tyrosine phosphatase, with a potential function in the regulation of T-cell and B-cell activation, it is of obvious interest for the study of the etiology of RA to know how this more recently described risk gene interacts with the classical HLA-DRB1 SE genes, as well as with smoking. Studies of interaction among risk factors in the epidemiological literature have classically been performed using a departure from the additivity model originally described by Rothman, where a term—the attributable proportion due to interaction (AP)—is used to quantify the contribution of interaction to a disease risk, as compared with the contribution of each of the two risk factors added to each other.10Ahlbom A Alfredsson L Interaction: a word with two meanings creates confusion.Eur J Epidemiol. 2005; 20: 563-564Crossref PubMed Scopus (160) Google Scholar, 11Rothman KJ Epidemiology: an introduction. Oxford University Press, New York2002Google Scholar, 12Andersson T Alfredsson L Kallberg H Zdravkovic S Ahlbom A Calculating measures of biological interaction.Eur J Epidemiol. 2005; 20: 575-579Crossref PubMed Scopus (846) Google Scholar This method can also be used to quantify gene-gene interactions for unlinked loci. An alternative common method for quantifying gene-gene interactions is based on the calculation of the two risk factors' product term in a logistic-regression model (multiplicative or statistical interaction). Recently, another method for detecting gene-gene interaction, based on deviation from independence of penetrance in two unlinked loci, was proposed.13Zhao J Jin L Xiong M Test for interaction between two unlinked loci.Am J Hum Genet. 2006; 79: 831-845Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (96) Google Scholar As reported in this article, we used these three methods to calculate interactions between the HLA-DRB1 SE alleles and PTPN22 risk allele (R620W) in three different major case-control studies of RA: the Swedish Epidemiological Investigation of Rheumatoid Arthritis (EIRA) study, the North American RA Consortium (NARAC) study, and a Dutch case-control study based on the Leiden early arthritis cohort.5Stolt P Bengtsson C Nordmark B Lindblad S Lundberg I Klareskog L Alfredsson L Quantification of the influence of cigarette smoking on rheumatoid arthritis: results from a population based case-control study, using incident cases.Ann Rheum Dis. 2003; 62: 835-841Crossref PubMed Scopus (460) Google Scholar, 14Bengtsson C Nordmark B Klareskog L Lundberg I Alfredsson L EIRA Study Group Socioeconomic status and the risk of developing rheumatoid arthritis: results from the Swedish EIRA study.Ann Rheum Dis. 2005; 64: 1588-1594Crossref PubMed Scopus (127) Google Scholar, 15Jawaheer D Seldin MF Amos CI Chen WV Shigeta R Monteiro J Kern M Criswell LA Albani S Nelson JL et al.A genomewide screen in multiplex rheumatoid arthritis families suggests genetic overlap with other autoimmune diseases.Am J Hum Genet. 2001; 68: 927-936Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar, 16Jawaheer D Lum RF Amos CI Gregersen PK Criswell LA Clustering of disease features within 512 multicase rheumatoid arthritis families.Arthritis Rheum. 2004; 50: 736-741Crossref PubMed Scopus (42) Google Scholar, 17Van Aken J van Bilsen JH Allaart CF Huizinga TW Breedveld FC The Leiden Early Arthritis Clinic.Clin Exp Rheumatol. 2003; 21: S100-S105PubMed Google Scholar We used the largest one of these, which is also the one in which smoking information is the most detailed (the EIRA study5Stolt P Bengtsson C Nordmark B Lindblad S Lundberg I Klareskog L Alfredsson L Quantification of the influence of cigarette smoking on rheumatoid arthritis: results from a population based case-control study, using incident cases.Ann Rheum Dis. 2003; 62: 835-841Crossref PubMed Scopus (460) Google Scholar, 6Padyukov L Silva C Stolt P Alfredsson L Klareskog L A gene-environment interaction between smoking and shared epitope genes in HLA-DR provides a high risk of seropositive rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum. 2004; 50: 3085-3092Crossref PubMed Scopus (484) Google Scholar, 7Klareskog L Stolt P Lundberg K Källberg H Bengtsson C Grunewald J Ronnelid J Harris HE Ulfgren AK Rantapaa-Dahlqvist S et al.A new model for an etiology of RA: smoking may trigger HLA-DR (SE)-restricted immune reactions to autoantigens modified by citrullination.Arthritis Rheum. 2006; 54: 38-46Crossref PubMed Scopus (1030) Google Scholar, 14Bengtsson C Nordmark B Klareskog L Lundberg I Alfredsson L EIRA Study Group Socioeconomic status and the risk of developing rheumatoid arthritis: results from the Swedish EIRA study.Ann Rheum Dis. 2005; 64: 1588-1594Crossref PubMed Scopus (127) Google Scholar), to calculate interaction between the PTPN22 risk allele and smoking, with regard to the risk of anti-CCP–positive RA, using the departure-from-additivity model. A significant interaction between HLA-DRB1 SE alleles and the PTPN22 R620W allele was seen with all methods when the three studies were pooled, but the departure-from-additivity model was able to identify interaction in each one of the studies analyzed separately, whereas the multiplicative model identified this interaction only when the three studies were pooled. No interaction was seen between smoking and PTPN22. This new description of the interaction patterns among the three major known risk factors of RA, which all work in one but not the other major subset of the disease, provides a basis for further etiologic investigations of this disease, with an increased emphasis on T-cell activation and specificity. In addition, the data illustrate the need for consideration and comparison of different methods for calculating interactions in complex diseases. This report is based on data from three different studies: (1) the EIRA, (2) the NARAC, and (3) the Leiden Early Arthritis Clinic (Leiden EAC). In each study, ethical permission was obtained from the relevant ethical committees, and all the participants consented to contribute to the study. In the EIRA study, we recruited cases and controls aged 18–70 years during May 1996 to December 2003 from a geographically defined area in the south and central regions of Sweden. A case was defined as a person in the study base who was given a first-time diagnosis of RA, according to the American College of Rheumatology (ACR) criteria of 1987,18Arnett FC Eworthy SM Bloch DA McShane DJ Fries JF Cooper NS Healey LA Kaplan SR Liang MH Luthra HS et al.The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum. 1988; 31: 315-324Crossref PubMed Scopus (17997) Google Scholar by rheumatologists at private as well as general health care units in the participating area. Controls were randomly selected from a continuously updated national population register, with consideration given to age, sex, and living area. If the selected control was not traceable, reported having RA, or refused to participate, a new control was selected using the same procedure. More details about the study are described in other reports of the EIRA study.5Stolt P Bengtsson C Nordmark B Lindblad S Lundberg I Klareskog L Alfredsson L Quantification of the influence of cigarette smoking on rheumatoid arthritis: results from a population based case-control study, using incident cases.Ann Rheum Dis. 2003; 62: 835-841Crossref PubMed Scopus (460) Google Scholar, 6Padyukov L Silva C Stolt P Alfredsson L Klareskog L A gene-environment interaction between smoking and shared epitope genes in HLA-DR provides a high risk of seropositive rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum. 2004; 50: 3085-3092Crossref PubMed Scopus (484) Google Scholar, 7Klareskog L Stolt P Lundberg K Källberg H Bengtsson C Grunewald J Ronnelid J Harris HE Ulfgren AK Rantapaa-Dahlqvist S et al.A new model for an etiology of RA: smoking may trigger HLA-DR (SE)-restricted immune reactions to autoantigens modified by citrullination.Arthritis Rheum. 2006; 54: 38-46Crossref PubMed Scopus (1030) Google Scholar, 14Bengtsson C Nordmark B Klareskog L Lundberg I Alfredsson L EIRA Study Group Socioeconomic status and the risk of developing rheumatoid arthritis: results from the Swedish EIRA study.Ann Rheum Dis. 2005; 64: 1588-1594Crossref PubMed Scopus (127) Google Scholar, 19Stolt P Kallberg H Lundberg I Sjogren B Klareskog L Alfredsson L Silica exposure is associated with increased risk of developing rheumatoid arthritis: results from the Swedish EIRA-study.Ann Rheum Dis. 2005; 64: 582-586Crossref PubMed Scopus (138) Google Scholar The second study used in this report, the NARAC, consists of affected sibling pairs who fulfilled the 1987 ACR criteria18Arnett FC Eworthy SM Bloch DA McShane DJ Fries JF Cooper NS Healey LA Kaplan SR Liang MH Luthra HS et al.The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum. 1988; 31: 315-324Crossref PubMed Scopus (17997) Google Scholar and matched, unrelated controls recruited from the New York Cancer Project. Details regarding NARAC are provided elsewhere.15Jawaheer D Seldin MF Amos CI Chen WV Shigeta R Monteiro J Kern M Criswell LA Albani S Nelson JL et al.A genomewide screen in multiplex rheumatoid arthritis families suggests genetic overlap with other autoimmune diseases.Am J Hum Genet. 2001; 68: 927-936Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar, 16Jawaheer D Lum RF Amos CI Gregersen PK Criswell LA Clustering of disease features within 512 multicase rheumatoid arthritis families.Arthritis Rheum. 2004; 50: 736-741Crossref PubMed Scopus (42) Google Scholar The third study used, the Leiden EAC, consists of patients with confirmed RA with early onset and hospital-based controls with and without deep venous thrombosis. Details on the Leiden EAC and the controls used are given elsewhere.17Van Aken J van Bilsen JH Allaart CF Huizinga TW Breedveld FC The Leiden Early Arthritis Clinic.Clin Exp Rheumatol. 2003; 21: S100-S105PubMed Google Scholar, 20van der Meer FJ Koster T Vandenbroucke JP Briet E The Leiden Thrombophilia Study (LETS).Thromb Haemost. 1997; 78: 631-635PubMed Google Scholar Analysis of anti-CCP antibodies for samples from the EIRA study, as well as for samples from the Leiden EAC, was made with the Immunoscan-RA Mark2 ELISA, as described elsewhere.2Huizinga TWJ Amos CI van der Helm-van Mil AHM Chen W van Gaalen FA Jawaheer D Schreuder GMT Wener M Breedvald FC Ahmad N et al.Refining the complex rheumatoid arthritis phenotype based on specificity of the HLA-DRB1 shared epitope for antibodies to citrullinated proteins.Arthritis Rheum. 2005; 52: 3433-3438Crossref PubMed Scopus (438) Google Scholar, 21Rönnelid J Wick MC Lampa J Lindblad S Nordmark B Klareskog L van Vollenhoven RF Longitudinal analysis of anti-citrullinated antibodies (anti-CP) during 5 years follow-up in early rheumatoid arthritis: anti-CP status is a stable phenotype that predicts worse disease activity and greater radiological progression.Ann Rheum Dis. 2005; 64: 1744-1749Crossref PubMed Scopus (260) Google Scholar Cases with serum antibody levels >25 U/ml were regarded as anti-CCP positive. Rheumatoid factor status for cases was determined using standard procedures. Antibodies toward CCP in NARAC cases were measured using a second-generation commercial anti-CCP ELISA (Inova Diagnostics). Cases with antibody levels >20 U/ml were regarded as anti-CCP positive. Genotyping procedure of the PTPN22 and HLA-DRB1 genes is described in previous articles.2Huizinga TWJ Amos CI van der Helm-van Mil AHM Chen W van Gaalen FA Jawaheer D Schreuder GMT Wener M Breedvald FC Ahmad N et al.Refining the complex rheumatoid arthritis phenotype based on specificity of the HLA-DRB1 shared epitope for antibodies to citrullinated proteins.Arthritis Rheum. 2005; 52: 3433-3438Crossref PubMed Scopus (438) Google Scholar, 4Begovich AB Carlton VE Honigberg LA Schrodi SJ Chokkalingam AP Alexander HC Ardlie KG Huang Q Smith AM Spoerke JM et al.A missense single-nucleotide polymorphism in a gene encoding a protein tyrosine phosphatase (PTPN22) is associated with rheumatoid arthritis.Am J Hum Genet. 2004; 75: 330-337Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1120) Google Scholar, 7Klareskog L Stolt P Lundberg K Källberg H Bengtsson C Grunewald J Ronnelid J Harris HE Ulfgren AK Rantapaa-Dahlqvist S et al.A new model for an etiology of RA: smoking may trigger HLA-DR (SE)-restricted immune reactions to autoantigens modified by citrullination.Arthritis Rheum. 2006; 54: 38-46Crossref PubMed Scopus (1030) Google Scholar, 8Linn-Rasker SP van der Helm-van Mil AH Van Gaalen FA Kloppenburg M de Vries R le Cessie S Breedveld FC Toes RE Huizinga TW Smoking is a risk factor for anti-CCP antibodies only in rheumatoid arthritis patients that carry HLA-DRB1 shared epitope alleles.Ann Rheum Dis. 2006; 65: 366-371Crossref PubMed Scopus (234) Google Scholar, 9Lundberg K Nijenhuis S Vossenaar E Palmblad K van Venrooij WJ Klareskog L Zendman AJ Harris HE Citrullinated proteins have increased immunogenicity and arthritogenicity and their presence in arthritic joints correlates with disease severity.Arthritis Res Ther. 2005; 7: R458-R467Crossref PubMed Google Scholar, 22Olerup O Zetterquist H HLA-DR typing by PCR amplification with sequence-specific primers (PCR-SSP) in 2 hours: an alternative to serological DR typing in clinical practice including donor-recipient matching in cadaveric transplantation.Tissue Antigens. 1992; 39: 225-235Crossref PubMed Scopus (1704) Google Scholar Allocation to SE was based on local guidelines as described elsewhere, with the HLA-DRB1 alleles DRB1*01, DRB1*04, and DRB1*10 defined as SE alleles. For simplicity of evaluation, we assumed a dominant A allele model for the PTPN22 R620W polymorphism and a dominant SE allele model. Subjects with SE alleles were classified as having single or double SE alleles, for a separate evaluation of a potential gene-dosage effect. Smoking was considered only for the EIRA study. On the basis of self-reported information from the EIRA questionnaire, we divided participants into “ever smokers” and “never smokers.” An ever smoker was defined as a person who had ever smoked cigarettes. A never smoker was defined as a person who had never smoked cigarettes, pipes, cigars, etc. We calculated odds ratios (ORs) and 95% CIs of developing anti-CCP–positive RA and anti-CCP–negative RA associated with each of the factors—PTPN22 R620W alleles, HLA-DRB1 SE alleles, and smoking—by means of logistic-regression models. We estimated their separate effects, as well as the effect of their simultaneous presence. All analyses based on the EIRA study were adjusted for the matching variables: age (10 categories), living area (11 categories), and sex, together with smoking and presence of HLA-DRB1 SE alleles when appropriate. Analyses based on the NARAC study or the Leiden EAC were adjusted for sex and age (using the same categories as in EIRA). Interaction effects between the presence of HLA-DRB1 SE and PTPN22 R620W alleles were evaluated using three different approaches. First, interaction between presence of HLA-DRB1 and PTPN22 R620W alleles was evaluated using departure from additivity of effects as the interaction criteria (biological interaction), as suggested by Rothman.10Ahlbom A Alfredsson L Interaction: a word with two meanings creates confusion.Eur J Epidemiol. 2005; 20: 563-564Crossref PubMed Scopus (160) Google Scholar, 11Rothman KJ Epidemiology: an introduction. Oxford University Press, New York2002Google Scholar To quantify the amount of interaction in terms of departure from additivity of effects, the AP was calculated together with the 95% CI.12Andersson T Alfredsson L Kallberg H Zdravkovic S Ahlbom A Calculating measures of biological interaction.Eur J Epidemiol. 2005; 20: 575-579Crossref PubMed Scopus (846) Google Scholar The AP is the proportion of the incidence among persons exposed to two interacting factors that is attributable to the interaction per se (i.e., reflecting their joint effect beyond the sum of their independent effects). A more detailed description regarding explanation, definition, and programs used to calculate AP with CIs is given elsewhere.10Ahlbom A Alfredsson L Interaction: a word with two meanings creates confusion.Eur J Epidemiol. 2005; 20: 563-564Crossref PubMed Scopus (160) Google Scholar, 12Andersson T Alfredsson L Kallberg H Zdravkovic S Ahlbom A Calculating measures of biological interaction.Eur J Epidemiol. 2005; 20: 575-579Crossref PubMed Scopus (846) Google Scholar, 23Hosmer DW Lemeshow S Confidence interval estimation of interaction.Epidemiology. 1992; 3: 452-456Crossref PubMed Scopus (767) Google Scholar We assessed the AP for each study as well as the pooled estimate when all studies were combined (with adjustment for study). To investigate potential mechanistic pathways further, we also calculated interaction effects between the presence of PTPN22 R620W alleles and smoking and between smoking and the presence of HLA-DRB1 SE alleles, using the departure-from-additivity–based method. Second, interaction between presence of HLA-DRB1 and PTPN22 R620W alleles was evaluated using the cross-product of the risk factors in a logistic-regression model as interaction criteria (multiplicative or statistical interaction).10Ahlbom A Alfredsson L Interaction: a word with two meanings creates confusion.Eur J Epidemiol. 2005; 20: 563-564Crossref PubMed Scopus (160) Google Scholar, 11Rothman KJ Epidemiology: an introduction. Oxford University Press, New York2002Google Scholar We also pooled the three studies, to increase power to detect multiplicative interaction. In the analysis of multiplicative interaction, we adjusted for age, living area (only EIRA), and sex, as well as for study in the pooled analysis. Third, we used a recently developed method to assess gene-gene interaction, which is based on deviation from independence of penetrance of two unlinked loci. This is referred to as the “linkage disequilibrium (LD) statistic.”13Zhao J Jin L Xiong M Test for interaction between two unlinked loci.Am J Hum Genet. 2006; 79: 831-845Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (96) Google Scholar We also calculated χ2 statistics to compare allele distribution in the different studies, for cases and controls separately. We used SAS software for Windows, version 9.1 (SAS Institute), to analyze the data. This report is based on a total of 1,977 cases and 2,405 controls, distributed across the different studies as follows: EIRA, 1,183 cases and 793 controls; NARAC, 430 cases and 731 controls; and Leiden EAC, 364 cases and 881 controls. The EIRA study mainly involved individuals born in Sweden. When those born outside Sweden were also taken into consideration, 97% were of white origin. Of the cases, ∼61% had anti-CCP–positive RA. The corresponding figures for presence of anti-CCP in the NARAC and the Leiden EAC studies were 81% and 56%, respectively. As published elsewhere,2Huizinga TWJ Amos CI van der Helm-van Mil AHM Chen W van Gaalen FA Jawaheer D Schreuder GMT Wener M Breedvald FC Ahmad N et al.Refining the complex rheumatoid arthritis phenotype based on specificity of the HLA-DRB1 shared epitope for antibodies to citrullinated proteins.Arthritis Rheum. 2005; 52: 3433-3438Crossref PubMed Scopus (438) Google Scholar, 4Begovich AB Carlton VE Honigberg LA Schrodi SJ

The Study Group for Risk Factors for Rheumatoid Arthritis was established by the EULAR Standing Committee on Investigative Rheumatology to facilitate research into the preclinical and earliest clinically apparent phases of rheumatoid arthritis (RA). This report describes the recommendation for terminology to be used to define specific subgroups during different phases of disease, and defines the priorities for research in this area. Terminology was discussed by way of a three-stage structured process: A provisional list of descriptors for each of the possible phases preceding the diagnosis of RA were circulated to members of the study group for review and feedback. Anonymised comments from the members on this list were fed back to participants before a 2-day meeting. 18 participants met to discuss these data, agree terminologies and prioritise important research questions. The study group recommended that, in prospective studies, individuals without RA are described as having: genetic risk factors for RA; environmental risk factors for RA; systemic autoimmunity associated with RA; symptoms without clinical arthritis; unclassified arthritis; which may be used in a combinatorial manner. It was recommended that the prefix ‘pre-RA with:’ could be used before any/any combination of the five points above but only to describe retrospectively a phase that an individual had progressed through once it was known that they have developed RA. An approach to dating disease onset was recommended. In addition, important areas for research were proposed, including research of other tissues in which an adaptive immune response may be initiated, and the identification of additional risk factors and biomarkers for the development of RA, its progression and the development of extra-articular features. These recommendations provide guidance on approaches to describe phases before the development of RA that will facilitate communication between researchers and comparisons between studies. A number of research questions have been defined, requiring new cohorts to be established and new techniques to be developed to image and collect material from different sites.

Abstract Objective The etiopathogenesis of primary Sjögren's syndrome (SS) is largely unknown. In other autoimmune diseases, type I interferon (IFN) may play a pivotal role by triggering and sustaining the disease process. We therefore aimed to determine whether patients with primary SS had an activated type I IFN system. Methods Salivary gland biopsy specimens and sera from patients with primary SS were investigated for the occurrence of IFNα‐producing cells and measurable IFNα levels, respectively. The ability of primary SS sera together with apoptotic or necrotic cells to induce IFNα production in normal peripheral blood mononuclear cells was examined. The IFNα inducer was characterized, and IFNα‐producing cells were identified. Clinical data were correlated with the IFNα‐inducing capacity of primary SS sera. Results Numerous IFNα‐producing cells were detected in salivary gland biopsy specimens, despite low serum IFNα levels. Autoantibodies to RNA‐binding proteins, combined with material released by necrotic or late apoptotic cells, were potent inducers of IFNα production in plasmacytoid dendritic cells (PDCs). This appeared to be attributable to RNA‐containing immune complexes triggering PDCs by means of RNA and interaction with Fcγ receptor IIa. The IFNα‐inducing capacity of sera was associated with positive results of a labial salivary gland biopsy (focus score ≥1) and with dermatologic, hematologic, and pulmonary manifestations. Conclusion Patients with primary SS have an activated type I IFN system. Although virus may initiate the production of IFN, the continued IFNα synthesis is caused by RNA‐containing immune complexes that activate PDCs to prolong IFNα production at the tissue level. This IFNα promotes the autoimmune process by a vicious circle–like mechanism, with increased autoantibody production and formation of more endogenous IFNα inducers.

Background Earlier studies have demonstrated that smoking and genetic risk factors interact in providing an increased risk of rheumatoid arthritis (RA). Less is known on how smoking contributes to RA in the context of genetic variability, and what proportion of RA may be caused by smoking. Objectives To determine the association between the amount of smoking and risk of RA in the context of different HLA-DRB1 shared epitope (SE) alleles, and to estimate proportions of RA cases attributed to smoking. Design, Setting and Participants Data from the Swedish Epidemiological Investigation of Rheumatoid Arthritis (EIRA) case–control study encompassing 1204 cases and 871 controls were analysed. Main Outcome Measure Estimated OR to develop RA and excess fraction of cases attributable to smoking according to the amount of smoking and genotype. Results Smoking was estimated to be responsible for 35% of anticitrullinated protein/peptide antibody (ACPA)-positive cases. For each HLA-DRB1 SE genotype, smoking was dose-dependently associated with an increased risk of ACPA-positive RA (p trend <0.001). In individuals carrying two copies of the HLA-DRB1 SE, 55% of ACPA-positive RA was attributable to smoking. Conclusions Smoking is a preventable risk factor for RA. The increased risk due to smoking is dependent on the amount of smoking and genotype.

Objective: To study serum levels of citrullinated protein/peptide antibodies (anti-CP) during up to 5 years' follow up of patients with early rheumatoid arthritis (RA), and to relate serum levels to disease course and to treatments in clinical practice. Methods: 279 patients with early RA were followed up with clinical investigations, radiographs, and measurement of anti-CP at baseline and after 3 months, 1, 2, 3, and 5 years. Results: 160/279 (57.3%) patients were anti-CP positive at the first visit (mean 5 months after first symptoms). During follow up only 11/279 (3.9%) of the patients changed their anti-CP status. Anti-CP levels fell significantly during the first year, and this drop correlated with the extent of sulfasalazine treatment but not with other drugs or clinical indices. Anti-CP positive and negative patients had similar disease activities at baseline, but during follow up the anti-CP positive patients had worse clinical disease and greater radiological progression, despite at least equally intensive antirheumatic treatment. Conclusions: Anti-CP are stable during the first 5 years of RA, suggesting that events before rather than after onset of clinical manifestations of disease determine this phenotype. The presence of anti-CP at diagnosis predicts a less favourable disease course and greater radiological progression despite antirheumatic treatment, but subsequent changes in antibody levels do not reflect changes in disease activity. Taken together, these observations suggest that anti-CP positive RA is a distinct clinical and pathophysiological entity.

Background

 Rheumatoid arthritis (RA) can be divided into two major subsets based on the presence or absence of antibodies to citrullinated peptide antigens (ACPA). Until now, data from genome-wide association studies (GWAS) have only been published from ACPA-positive subsets of RA or from studies that have not separated the two subsets. The aim of the current study is to provide and compare GWAS data for both subsets. 

Methods

 and results GWAS using the Illumina 300K chip was performed for 774 ACPA-negative patients with RA, 1147 ACPA-positive patients with RA and 1079 controls from the Swedish population-based case–control study EIRA. Imputation was performed which allowed comparisons using 1 723 056 single nucleotide polymorphisms (SNPs). No SNP achieved genome-wide significance (2.9 × 10^–8) in the comparison between ACPA-negative RA and controls. A case–case association study was then performed between ACPA-negative and ACPA-positive RA groups. The major difference in this analysis was in the HLA region where 768 HLA SNPs passed the threshold for genome-wide significance whereas additional contrasting SNPs did not reach genome-wide significance. However, one SNP close to the RPS12P4 locus in chromosome 2 reached a p value of 2 × 10⁶ and this locus can thus be considered as a tentative candidate locus for ACPA-negative RA. 

Conclusions

 ACPA-positive and ACPA-negative RA display significant risk allele frequency differences which are mainly confined to the HLA region. The data provide further support for distinct genetic aetiologies of RA subsets and emphasise the need to consider them separately in genetic as well as functional studies of this disease.

Background:

 Collagen type II (CII) is the major protein in hyaline cartilage. We have previously detected anti-CII autoantibodies in a small subgroup (7-9%) of rheumatoid arthritis (RA) patients at the time of diagnosis (1,2). After forming immune complexes with surface-bound CII in vitro, anti-CII induce cytokines and chemokines via FcgRIIa- and TLR4-dependent mechanisms (3, 4). In our previous studies, the levels of anti-CII antibodies dropped during the first months after RA diagnosis, in parallel to declines in cytokine induction in vitro and declines in levels of CRP and ESR in vivo, arguing that anti-CII may be functionally active in vivo (1). We therefore hypothesize that anti-CII antibodies drive and identify an acute onset rheumatoid arthritis phenotype, and prognosticate a favourable clinical outcome. This has previously been shown to be the case in two Swedish RA cohorts (1,2) but not yet investigated in RA cohorts from other countries. 

Objectives:

 To extend our two Swedish clinical investigations on anti-CII antibodies (1, 2) to other early RA cohorts. 

Methods:

 221 DMARD-naïve RA patients fulfilling the 2010 ACR/EULAR classification criteria with less than 2 years of symptom duration from the Norwegian ARCTIC (NCT01205854) strategy trial (5) were included between 2010-2013. All patients were treated with the same DMARD escalation strategy, with 13 visits during 2 years (5). Patients were followed with ultrasound (grey scale and power Doppler), DAS28 and its components, and markers of systemic inflammation including CRP, ESR and plasma calprotectin, as well as health-related quality of life measured with EQ-5D. IgG antibodies against native human CII were investigated with ELISA performed at Uppsala University in samples obtained at baseline and after 1, 2, 3, 6, 12, 16 and 24 months. The cut-off for positive reactions was set at the 95^th percentile among population controls, in agreement with our previous publications (1, 2). The study was performed as part of the ScandRA consortium aiming at biomarkers for precision medicine in RA. 

Results:

 Mean age was 54 years, and 61% were females. Mean DAS28 at inclusion was 4.4. Anti-CII antibodies were found in 35/221 (16%) of the patients; without significant clinical differences compared to anti-CII negative patients. Most of the anti-CII positive patients remained positive during follow-up, but for five of the 35 initially anti-CII positive patients the anti-CII levels decreased > 50% during the first three months (denoted "anti-CII pos" in figures). These five patients differed from all other patients at baseline, showing higher CRP (median 54 vs. 7 mg/L; p=0.0026), calprotectin (196 vs. 14 AU/mL; p=0.01), swollen joint counts (17 vs. 6; p=0.0009), sum scores for ultra sound power Dopper (31 vs. 6; p=0.0005) and grey scale (54 vs. 17; p=0.0008). They also showed higher SDAI (51.1 vs. 22.1; p=0.001) and DAS28 (5.81 vs. 4.41; p=0.02) at inclusion. During the two-year follow-up, the differences between the groups disappeared, and inversed to a trend towards significantly lower CRP, calprotectin, SDAI and DAS28 among the five initially anti-CII positive patients (Figure 1). The initial differences in swollen joint counts and ultrasound measures disappeared (Figure 2), and the initially anti-CII positive patients ended up with significantly higher scores for EQ-5D (Figure 2). 

Conclusion:

 Anti-CII antibodies can be detected in early RA. RA patients with initially elevated anti-CII levels that decline during the first three months have an inflammatory presentation followed by a benign course during the first two years. Although the fraction of anti-CII positive RA patients is low, the corresponding clinical phenotype is strong and penetrant. Measurement of anti-CII may be a clinically useful biomarker to distinguish early RA patients with initially high disease activity but with a good long-term prognosis following optimized medical treatment. 

REFERENCES:

 [1] Mullazehi M et al. Ann Rheum Dis 2007;66:537-41 [2] Manivel VA et al. Ann Rheum Dis 76(9):1529-1536 [3] Mullazehi M et al. Arthritis Rheum 2006; 54(6):1759-71 [4] Manivel VA et al Eur J Immunol 2016; 46(12):2822-2834 [5] Haavardsholm EA et al. BMJ 2016;354:i4205 

Acknowledgements:

 The study was performed as part of the ScandRA consortium aiming at biomarkers for precision medicine in RA. 

Disclosure of Interests:

 Johan Rönnelid Renumeration for lectures given for Thermo Fisher Scientific, Scientific Advisory Board member for Thermo Fisher Scientific and Inova/Werfen., Christine Möller Westerberg: None declared, Anna Svanqvist: None declared, Hilde Berner Hammer AbbVie, Lilly, Novartis, UCB, Joe Sexton: None declared, Linda Mathsson Thermo Fisher Scientific, Isabel Gehring Thermo Fisher Scientific, Johan Askling Agreements between Karolinska Institutet (with JA as PI) and Abbvie, BMS, Eli Lilly, Galapagos, MSD, Pfizer, Roche, Samsung Bioepis, Sanofi, mainly for the national safety monitoring of rheumatology immunomodulators in Sweden (ARTIS), Helga Westerlind: None declared, Siri Lillegraven: None declared, Espen A Haavardsholm: None declared.