Fibrillogenesis of the amyloid β-protein (Aβ) is a seminal pathogenetic event in Alzheimer's disease. Inhibiting fibrillogenesis is thus one approach toward disease therapy. Rational design of fibrillogenesis inhibitors requires elucidation of the stages and kinetics of Aβ fibrillogenesis. We report results of studies designed to examine the initial stages of Aβ oligomerization. Size exclusion chromatography, quasielastic light scattering spectroscopy, and electron microscopy were used to characterize fibrillogenesis intermediates. After dissolution in 0.1 m Tris-HCl, pH 7.4, and removal of pre-existent seeds, Aβ chromatographed almost exclusively as a single peak. The molecules composing the peak had average hydrodynamic radii of 1.8 ± 0.2 nm, consistent with the predicted size of dimeric Aβ. Over time, an additional peak, with a molecular weight >100,000, appeared. This peak contained predominantly curved fibrils, 6–8 nm in diameter and <200 nm in length, which we have termed “protofibrils.” The kinetics of protofibril formation and disappearance are consistent with protofibrils being intermediates in the evolution of amyloid fibers. Protofibrils appeared during the polymerization of Aβ-(1–40), Aβ-(1–42), and Aβ-(1–40)-Gln22, peptides associated with both sporadic and inherited forms of Alzheimer's disease, suggesting that protofibril formation may be a general phenomenon in Aβ fibrillogenesis. If so, protofibrils could be attractive targets for fibrillogenesis inhibitors. Fibrillogenesis of the amyloid β-protein (Aβ) is a seminal pathogenetic event in Alzheimer's disease. Inhibiting fibrillogenesis is thus one approach toward disease therapy. Rational design of fibrillogenesis inhibitors requires elucidation of the stages and kinetics of Aβ fibrillogenesis. We report results of studies designed to examine the initial stages of Aβ oligomerization. Size exclusion chromatography, quasielastic light scattering spectroscopy, and electron microscopy were used to characterize fibrillogenesis intermediates. After dissolution in 0.1 m Tris-HCl, pH 7.4, and removal of pre-existent seeds, Aβ chromatographed almost exclusively as a single peak. The molecules composing the peak had average hydrodynamic radii of 1.8 ± 0.2 nm, consistent with the predicted size of dimeric Aβ. Over time, an additional peak, with a molecular weight >100,000, appeared. This peak contained predominantly curved fibrils, 6–8 nm in diameter and <200 nm in length, which we have termed “protofibrils.” The kinetics of protofibril formation and disappearance are consistent with protofibrils being intermediates in the evolution of amyloid fibers. Protofibrils appeared during the polymerization of Aβ-(1–40), Aβ-(1–42), and Aβ-(1–40)-Gln22, peptides associated with both sporadic and inherited forms of Alzheimer's disease, suggesting that protofibril formation may be a general phenomenon in Aβ fibrillogenesis. If so, protofibrils could be attractive targets for fibrillogenesis inhibitors. Fibrillar amyloid plaques in the cerebral parenchyma and vasculature are a cardinal neuropathologic feature of Alzheimer's disease (AD) 1The abbreviations used are: AD, Alzheimer's disease; Aβ, amyloid β-protein; QLS, quasielastic light scattering spectroscopy; PAGE, polyacrylamide gel electrophoresis; SEC, size exclusion chromatography; HPLC, high pressure liquid chromatography; HFIP, 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol; RIA, radioimmunoassay; Tricine,N-[2-hydroxy-1,1-bis(hydroxymethyl)ethyl]glycine. (1Selkoe D.J. Neuron. 1991; 6: 487-498Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (2294) Google Scholar). Plaques are composed predominantly of insoluble fibers of the amyloid β-protein (Aβ) (2Glenner G.G. Wong C.W. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984; 120: 885-890Crossref PubMed Scopus (4434) Google Scholar). Aβ is a normal component of the plasma and cerebrospinal fluid, occurring as a soluble 40- or 42-residue peptide (3Seubert P. Vigo-Pelfrey C. Esch F. Lee M. Dovey H. Davis D. Sinha S. Schlossmacher M.G. Whaley J. Swindlehurst C. McCormack R. Wolfert R. Selkoe D.J. Lieberburg I. Schenk D. Nature. 1992; 359: 325-327Crossref PubMed Scopus (1666) Google Scholar, 4Busciglio J. Gabuzda D.H. Matsudaira P. Yankner B.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993; 90: 2092-2096Crossref PubMed Scopus (550) Google Scholar). Thus, a central question in the etiology of AD is the mechanism(s) by which these soluble Aβ molecules are converted into plaque-associated fibers (5Selkoe D.J. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1994; 53: 438-447Crossref PubMed Scopus (715) Google Scholar). This question is particularly relevant because Aβ fibers, unlike nonfibrillar Aβ, are neurotoxic in vitro and are associated with damaged neuropil in vivo(6Yankner B.A. Nat. Med. 1996; 2: 850-852Crossref PubMed Scopus (109) Google Scholar). These observations suggest that inhibiting fiber formation would be an effective approach toward AD therapy. However, if these efforts are to succeed, fiber formation must be understood at the molecular level. Aβ fibrillogenesis is a nucleation-dependent polymerization process (7Jarrett J.T. Lansbury Jr., P.T. Cell. 1993; 73: 1055-1058Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1981) Google Scholar, 8Lomakin A. Chung D.S. Benedek G.B. Kirschner D.A. Teplow D.B. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 1125-1129Crossref PubMed Scopus (744) Google Scholar). The kinetics of this type of process is controlled by two key parameters, nucleation rate and elongation rate. Past studies of the kinetics of Aβ fibrillogenesis, utilizing techniques including turbidity, sedimentation, and thioflavine T binding, could only provide information on the appearance of high molecular weight aggregates (7Jarrett J.T. Lansbury Jr., P.T. Cell. 1993; 73: 1055-1058Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1981) Google Scholar, 9LeVine III, H. Protein Sci. 1993; 2: 404-410Crossref PubMed Scopus (2004) Google Scholar) or the disappearance of soluble peptide (10Clements A. Walsh D.M. Williams C.H. Allsop D. Neurosci. Lett. 1993; 161: 17-20Crossref PubMed Scopus (81) Google Scholar, 11Clements A. Allsop D. Walsh D.M. Williams C.H. J. Neurochem. 1996; 66: 740-747Crossref PubMed Scopus (112) Google Scholar, 12Mantyh P.W. Ghilardi J.R. Rogers S. DeMaster E. Allen C.J. Stimson E.R. Maggio J.E. J. Neurochem. 1993; 61: 1171-1174Crossref PubMed Scopus (438) Google Scholar, 13Snyder S.W. Ladror U.S. Wade W.S. Wang G.T. Barrett L.W. Matayoshi E.D. Huffaker H.J. Krafft G.A. Holzman T.F. Biophys. J. 1994; 67: 1216-1228Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (353) Google Scholar). Neither rate constants nor structures of fibrillogenesis intermediates could be determined by these approaches. In contrast, the technique of quasielastic light scattering spectroscopy (QLS) is particularly well suited for resolving individual stages of polymerization processes and for examining polymerization kinetics (14Cohen R.J. Benedek G.B. Immunochemistry. 1975; 12: 349-351Crossref PubMed Scopus (44) Google Scholar). QLS was used initially to monitor late stages of Aβ fibrillogenesis (15Tomski S.J. Murphy R.M. Arch. Biochem. Biophys. 1992; 294: 630-638Crossref PubMed Scopus (139) Google Scholar, 16Shen C.-L. Scott G.L. Merchant F. Murphy R.M. Biophys. J. 1993; 65: 2383-2395Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (88) Google Scholar). Recently, however, a model system was developed for the highly reproducible growth of Aβ fibers (8Lomakin A. Chung D.S. Benedek G.B. Kirschner D.A. Teplow D.B. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 1125-1129Crossref PubMed Scopus (744) Google Scholar). This allowed QLS monitoring of polymer size during all phases of fibrillogenesis and determination of the rates of Aβ fibril nucleation and elongation (8Lomakin A. Chung D.S. Benedek G.B. Kirschner D.A. Teplow D.B. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 1125-1129Crossref PubMed Scopus (744) Google Scholar). The QLS approach is less useful for studying small structures, such as Aβ monomers and oligomers, when they exist in mixtures with larger polymers. Because these prefibrillar intermediates are potential targets for fibrillogenesis inhibitors, it is important to characterize them. One method for doing so is SDS-PAGE (17Hilbich C. Kisters-Woike B. Reed J. Masters C. Beyreuther K. J. Mol. Biol. 1991; 218: 149-163Crossref PubMed Scopus (564) Google Scholar, 18Burdick D. Soreghan B. Kwon M. Kosmoski J. Knauer M. Henschen A. Yates J. Cotman C. Glabe C. J. Biol. Chem. 1992; 267: 546-554Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 19Pike C.J. Burdick D. Walencewicz A.J. Glabe C.G. Cotman C.W. J. Neurosci. 1993; 13: 1676-1687Crossref PubMed Google Scholar, 20Soreghan B. Kosmoski J. Glabe C. J. Biol. Chem. 1994; 269: 28551-28554Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). However, since many Aβ polymers are SDS-labile, interpreting SDS-PAGE studies of Aβ polymerization is problematic. Size exclusion chromatography (SEC) is an attractive alternative to SDS-PAGE because it fractionates on the basis of molecular weight and is performed using nondenaturing and nondisaggregating buffers. SEC has been used to study the aggregation state of Aβ in solution (20Soreghan B. Kosmoski J. Glabe C. J. Biol. Chem. 1994; 269: 28551-28554Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 21Barrow C.J. Yasuda A. Kenny P.T.M. Zagorski M. J. Mol. Biol. 1992; 225: 1075-1093Crossref PubMed Scopus (628) Google Scholar, 22Bush A.I. Pettingell Jr., W.H. de Paradis M. Tanzi R.E. J. Biol. Chem. 1994; 269: 12152-12158Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 23Kametani F. Tanaka K. Tokuda T. Allsop D. Brain Res. 1995; 703: 237-241Crossref PubMed Scopus (13) Google Scholar), but its potential in kinetic studies has not been exploited. We report here the use of SEC, coupled with QLS and electron microscopy, to characterize the temporal evolution and structures of oligomeric intermediates in the pathway of Aβ fibrillogenesis. Chemicals were obtained from Sigma and, unless otherwise stated, were of the highest purity available. Solvents were HPLC grade and were obtained from Fisher. Water was double-distilled and deionized using a Milli-Q system (Millipore Corp., Bedford, MA). Peptides were synthesized as described by Lomakin et al. (8Lomakin A. Chung D.S. Benedek G.B. Kirschner D.A. Teplow D.B. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 1125-1129Crossref PubMed Scopus (744) Google Scholar). Crude Aβ-(1–40) was purified by reverse phase HPLC using a Vydac phenyl column (22 × 250 mm) and a linear gradient of 28–56% B over 50 min (A: 0.1% (v/v) trifluoroacetic acid; B: 70% (v/v) acetonitrile (CH3CN), 0.09% (v/v) trifluoroacetic acid) at a flow rate of 20 ml/min. Aβ-(1–42) was purified using a PLRP-S column (25 × 150 mm) and a linear gradient of 20–60% B over 80 min (A: 50 mm Tris-HCl, pH 9.1; B: 50 mm Tris-HCl, pH 9.1, containing 54% (v/v) CH3CN and 6% (v/v) 2-propanol) at a flow rate of 15 ml/min (24Naslund J. Karlstrom A.R. Tjernberg L.O. Schierhorn A. Terenius L. Nordstedt C. J. Neurochem. 1996; 67: 294-301Crossref PubMed Scopus (30) Google Scholar). Following purification, Aβ-(1–42) was dialyzed against 0.15m ammonium hydroxide in 40% (v/v) CH3CN, lyophilized, and converted to its trifluoroacetic acid salt by dissolution in 100% trifluoroacetic acid. Peptide mass, purity, and quantity were determined by a combination of matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, analytical HPLC, and quantitative amino acid analysis, respectively. Purified peptides were aliquoted, lyophilized, and stored at−20 °C until used. Aβ-(40–1) was generously provided by Dr. Dennis Selkoe (Brigham & Women's Hospital and Harvard Medical School). A description of columns and buffers is found in Table I. Superdex, Superose and TSK columns were attached to a Rainin HPLC system consisting of a HPXL pump, a Rheodyne 7161 injector, and a Dynamax UV-1 detector. Columns were eluted at a flow rate of 0.5 ml/min and peptides detected by UV absorbance at 254 nm. Sephadex G-50 (superfine) media were prepared using either 1 × 30 cm or 1 × 50 cm borosilicate Econo-columns (Bio-Rad, Hercules, CA) and eluted at 0.17 ml/min using an LKB Microperpex S peristaltic pump. Peptides were detected by UV absorbance at 254 nm using a Pharmacia UV-1 single path monitor. Each experiment was performed at least two times. Pre-packed columns were washed with 50% (v/v) formic acid between experiments. Sephadex columns were prepared from fresh resin prior to each experiment.Table IChromatographic properties of Aβ-(1–40)ColumnSeparation range (kDa)Elution buffer1-aMPD, 2-methyl-2,4-pentanediol; PBS, phosphate-buffered saline; TBS, Tris-buffered saline; TBSE, 0.02 m Tris-HCl, pH 7.4, containing 0.1 m NaCl and 50 μmEDTA.Aβ MrVoid peakCorrelation coefficient (r 2)Superdex 75 (1 × 30 cm)3 –70PBS10,000−0.98PBS, 20% sucrose10,500−0.98PBS, 20% MPD9,000−0.96PBS, 20% ethylene glycol8,000±0.98PBS, 50% ethylene glycol6,000±0.980.1 m Tris-HCl, pH 7.415,000+0.81Superdex 200 (1 × 30 cm)10 –6000.1 m Tris-HCl, pH 7.414,000+0.77Superose 12 (1 × 30 cm)1 –3000.1 m Tris-HCl, pH 7.415,000+0.79PBS12,000±0.92TSK G2000sw (0.7 × 30 cm)5 –1000.1% trifluoroacetic acid8,000−0.85PBS18,000±0.58G50sf (1 × 28 cm)1.5 –300.1 mTris-HCl, pH 7.49,000−0.98G50sf (1 × 28 cm)TBS8,000−1.0G50sf (1 × 47 cm)TBSE7,500−0.98G50sf (1 × 47 cm)50 mm ammonium acetate, pH 7.45,000−0.98Aβ-(1–40) was chromatographed on five different size exclusion media, as described under “Experimental Procedures.” For each study, the appropriate column was equilibrated with at least three column volumes of elution buffer and then calibrated with five molecular weight standards: avian ovalbumin (44,000); equine myoglobin (17,000); equine cytochrome C (12,384); bovine aprotinin (6,500); and vitamin B12 (1,350). Standard curves were constructed by regression analysis and used to determine the molecular weights of analytes. Each condition yielded one peak, which decreased in size over 24 h. A small void peak appeared after 24 h of incubation in some experiments.1-a MPD, 2-methyl-2,4-pentanediol; PBS, phosphate-buffered saline; TBS, Tris-buffered saline; TBSE, 0.02 m Tris-HCl, pH 7.4, containing 0.1 m NaCl and 50 μmEDTA. Open table in a new tab Aβ-(1–40) was chromatographed on five different size exclusion media, as described under “Experimental Procedures.” For each study, the appropriate column was equilibrated with at least three column volumes of elution buffer and then calibrated with five molecular weight standards: avian ovalbumin (44,000); equine myoglobin (17,000); equine cytochrome C (12,384); bovine aprotinin (6,500); and vitamin B12 (1,350). Standard curves were constructed by regression analysis and used to determine the molecular weights of analytes. Each condition yielded one peak, which decreased in size over 24 h. A small void peak appeared after 24 h of incubation in some experiments. 400 μg of Aβ-(1–40) were dissolved in 200 μl of water and then vortexed briefly. 200 μl of 2 × buffer were then added, and the sample was vortexed again. Following centrifugation (17,000 × g, 3 min), 100 μl of the supernatant was chromatographed. For kinetic analyses, samples were incubated at room temperature for various periods prior to centrifugation. For quasielastic light scattering spectroscopy, electron microscopy, and gel electrophoresis, Aβ-(1–40) was dissolved at a concentration of 2 mg/ml (0.46 mm), incubated at room temperature for 48 h, and then chromatographed as above. Similarly, Aβ-(1–40)-Gln22 and Aβ-(1–42) were dissolved at concentrations of 1 mg/ml (0.23 and 0.22 mm, respectively) and incubated at room temperature for 6 h, and then 300 μl of each were chromatographed as above. Peak fractions of 50–200-μl volume were collected and analyzed. Disaggregation experiments were performed by dissolving 800 μg of Aβ-(1–40) in 160 μl of 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) and incubating at room temperature for 10 min. The HFIP was removed by evaporation under a gentle stream of argon, leaving a slightly yellow film that was resuspended in 80 μl of dimethyl sulfoxide (Me2SO) and sonicated for 30 min. The solution was then filtered through an Anotop 10 Plus filter (20 nm, Whatman Inc., Clifton, NJ) and diluted 1:9 (v/v) with 0.1 m Tris-HCl, pH 7.4, containing 0.02% (w/v) sodium azide (Tris buffer). After centrifugation (17,000 × g, 3 min), 100 μl of supernatant were injected onto a Superdex 75 column. The remainder of the solution was incubated at room temperature and sampled at 1, 4, 8, and 24 h. To search for low abundance intermediates, radioiodinated Aβ-(1–40) (125I-Aβ, ∼2000 Ci/mmol) was prepared according to Maggio et al.(25Maggio J.E. Stimson E.R. Ghilardi J.R. Allen C.J. Dahl C.E. Whitcomb D.C. Vigna S.R. Vinters H.V. Labenski M.E. Mantyh P.W. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992; 89: 5462-5466Crossref PubMed Scopus (205) Google Scholar) at a final concentration of 100 pm in Tris buffer containing 0.5% (v/v) Me2SO. After incubation at room temperature for 0, 8, or 24 h, samples were centrifuged (17,000 × g, 3 min), and 100-μl aliquots were injected onto a Superdex 75 column. 0.5-ml fractions were collected, and their radioactivity was determined by scintillation counting. To examine the effect of varying Aβ concentration, 3 μl of appropriately diluted Aβ-(1–40) were added to 597 μl of Tris buffer containing 100 pm125I-Aβ, to yield final Aβ concentrations of 1 × 10−10, 1 × 10−9, 1 × 10−7, 1 × 10−5, and 2.3 × 10−4m. Samples were then incubated and analyzed as above. A RIA procedure was used to detect trace levels of oligomeric fibril intermediates. Aβ-(1–40) was dissolved in HFIP, lyophilized, dissolved to a suitable concentration in Me2SO, and then diluted 1:200 (v/v) with 0.1 m Tris buffer. Final Aβ concentrations were 1 × 10−7, 1 × 10−6, 1 × 10−5, and 1 × 10−4m. Samples were then incubated and chromatographed as in the radiotracer experiments. Fractions were frozen at −20 °C until assayed. Aβ-(1–40) content in each fraction was determined by RIA (26Esler W.P. Stimson E.R. Jennings J.M. Ghilardi J.R. Mantyh P.W. Maggio J.E. J. Neurochem. 1996; 66: 723-732Crossref PubMed Scopus (126) Google Scholar). Fractions from SEC were collected directly into cuvettes and analyzed within 1 min of elution. QLS was carried out essentially as described (8Lomakin A. Chung D.S. Benedek G.B. Kirschner D.A. Teplow D.B. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 1125-1129Crossref PubMed Scopus (744) Google Scholar). Measurements were performed at 25 °C using a Langley Ford model 1097 autocorrelator and Coherent argon ion lasers (model Innova 90 or Innova 90-plus) operated at 514 nm. 10 μl of sample were applied to carbon-coated Formvar grids (Electron Microscopy Sciences, Washington, PA) and incubated for 60 s. The droplet was then displaced with an equal volume of 0.5% (v/v) glutaraldehyde solution and incubated for an additional 60 s. The grid then was washed with four or five drops of water and wicked dry. Finally, the peptide was stained with 10 μl of 2% (w/v) uranyl acetate solution (Ted Pella, Inc., Redding, CA) for 2 min. This solution was wicked off, and the grid was air-dried. Samples were examined using a JEOL CX100 electron microscope. To examine insoluble material, pellets of Aβ were suspended in a small volume of buffer and prepared as above. SDS-PAGE was carried out on 16.5% Tricine gels as described by Schagger and Von Jagow (27Schagger H. Von Jagow G. Anal. Biochem. 1987; 166: 368-379Crossref PubMed Scopus (11027) Google Scholar). Aliquots of each chromatographic fraction (20 μl) were mixed with 3 × SDS sample buffer (10 μl) and boiled for 5 min immediately prior to electrophoresis. Gels were silver-stained using the Bio-Rad silver stain kit and photographed. To monitor oligomerization of Aβ, an analytical method is necessary that can resolve monomeric Aβ and its oligomers under nondenaturing, nondisaggregating conditions. We reasoned that SEC would be appropriate for this purpose. Initial analysis of presumably monomeric Aβ revealed a single peak with a molecular weight of 10,000 (Table I). This unexpectedly high molecular weight suggested that Aβ might not be monomeric or was partially excluded from the column matrix, indicating a nonideal analyte-matrix interaction. Because accurate molecular weight determination was critical for the proper interpretation of our experiments, we determined whether the chromatographic behavior of Aβ varied depending on column matrix or elution conditions (Table I). When Aβ-(1–40) from the same peptide lot was dissolved in phosphate-buffered saline and chromatographed on Superdex 75 (dextran-agarose), Superose 12 (agarose), or TSK (silica) matrices, the relative molecular weight of Aβ varied from 10,000 to 18,000. Similarly, when Aβ-(1–40) was dissolved in 0.1 mTris-HCl, pH 7.4, and then analyzed, molecular weights of 9,000–15,000 were observed. Other solvent conditions resulted inMr values ranging from 5,000 to 10,500. One explanation for the variations in Mr was nonideal chromatographic behavior of Aβ. This was confirmed in experiments in which the elution buffer was modified by the addition of ethylene glycol, an agent used to inhibit solute-column interactions. Under these conditions, a concentration-dependent decrease in Aβ Mr from 10,000 to 6,000 was seen. We also found that Mr values varied depending on the calibration standards used. Thus, for consistency, all columns were calibrated using the same five standards. In each experiment, Aβ-(1–40) chromatographed as a single peak in the included volume of the column, but because of its nonideal behavior, the oligomerization state of Aβ within these peaks was unclear. If noncovalent multimers composed these peaks, then treating Aβ with strong denaturants or solvents prior to chromatography might disaggregate these complexes and reduce the Mr. In fact, pretreatment of Aβ with SDS-PAGE sample buffer, Me2SO, HFIP, or 90% formic acid, had no effect on itsMr. In addition, Aβ-(40–1), the “reverse” peptide of Aβ-(1–40) and one that does not polymerize readily, co-eluted with Aβ-(1–40) on the Superdex 75/Tris-HCl system (data not shown). A time-dependent decrease in the magnitude of the gel-included peak was observed under all conditions examined (data not shown). In the Superdex 75/Tris-HCl system, this decrease was accompanied by the appearance of a new peak in the void volume of the column (Fig. 1). For linear polymers such as dextran, this would be consistent with a molecular weight in excess of 30,000. To better estimate the size of the aggregates in this peak, chromatography was also performed on Superdex 200 and Superose 12 columns, which have exclusion limits (for dextrans) of ∼100 kDa. A peak was observed in the void volume of these columns as well, suggesting that the Aβ multimers had molecular masses in excess of 100 kDa, or that they too behaved anomalously on SEC. Experiments using Aβ-(1–42) yielded essentially identical results (data not shown). To estimate the actual sizes of Aβ particles in the peaks obtained by SEC, QLS was used to measure the average diffusion coefficient of the particles. Particle size is expressed as the radius of a sphere with an identical diffusion coefficient. This quantity is termed the hydrodynamic radius (RH) (for a review, see Ref. 28Pecora R. Dynamic Light Scattering: Applications of Photon Correlation Spectroscopy.in: Pecora R. Plenum Press, New York, NY1985Crossref Google Scholar) and is conceptually equivalent to a Stoke's radius in gel permeation chromatography. For spherical particles, RH = r, wherer is the geometric radius. For a fibril,RH depends on the length, diameter, and flexibility of the particle. RH is always less than the radius of the sphere circumscribed around the particle. Immediately after dissolution in Tris-HCl and centrifugation (17,000 × g, 3 min), but prior to SEC, soluble Aβ-(1–40) had an average RH of ∼40–200 nm (Fig. 2 A). Because scattering intensity is proportional to molecular weight, monomers and small oligomers can be difficult to detect in the presence of larger polymers and aggregates. However, by fractionating the Aβ mixture using SEC, we observed a gel-included fraction, with an extrapolated molecular weight of 15,000, which had an average RH of 1.8 ± 0.2 nm (Fig. 2 B). Geometric considerations predict that a 4,331-Da peptide in dimeric form will have aRH = 1.5–2.1 nm. For comparison, QLS analysis of aprotinin (6,500 Da) fractionated by SEC yielded an averageRH of 1.6 ± 0.6 nm (Fig. 2 C). These data argue that Aβ existed as a dimer 2For simplicity, Aβ within the gel-included peak will be referred to as “dimeric.” However, the QLS data alone do not eliminate the possibility that Aβ within this peak is monomeric. in the gel-included fraction, not as a trimer or tetramer as suggested by SEC. We next sought to determine the size(s) of the Aβ oligomers in the gel-excluded fraction. To produce sufficient material for analysis, Aβ-(1–40) was incubated for 48 h prior to chromatography. QLS analysis of the pre-SEC supernatant (17,000 × g) revealed a broad distribution of particles sizes (range 4 to >100 nm) (Fig. 2 E). Comparison of this distribution with that obtained from Aβ immediately after dissolution (Fig. 2 A) shows that particles of intermediate size form during fibrillogenesis. Dimers were not resolved clearly in this experiment due to the predominance of larger Aβ oligomers/polymers, as discussed above. QLS analysis of the gel-excluded peak showed that the majority of intermediate particles ranged in size from ∼10 to 50 nm (Fig. 2 F). For a solution of noninteracting rods with diameters of 8 nm, this range corresponds to lengths of 30–500 nm. These lengths would be significantly smaller if rod-rod interactions were occurring. On the other hand, if the rods were flexible, the lengths would be even larger. Taken together, our SEC and QLS data indicate that the gel-included peak contained dimeric Aβ, the gel-excluded peak contained a distribution of oligomers, and the pellet obtained prior to chromatography was composed of higher molecular weight polymers and aggregates. To determine the morphology of the Aβ species observed in the SEC experiments, electron microscopy was performed. For both Aβ-(1–40) and Aβ-(1–42), no structures were detected in the gel-included fractions, while the 17,000 ×g pellets obtained prior to chromatography contained a mesh of fibers 6–10 nm in diameter (Fig. 3,A and B). These fibers were indistinguishable from those found in senile plaques (29Kirschner D.A. Abraham C. Selkoe D.J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1986; 83: 503-507Crossref PubMed Scopus (500) Google Scholar). In addition, particularly in the case of Aβ-(1–42), short fibrils were seen associated with the longer fibers. Generally, one end of each fibril appeared to adhere to the side of a fiber, while the other end was free. Similar fibrils were found in the void volume peaks, where they appeared as short, curly fibrils 6–10 nm in diameter and 5–160 nm in length, on average (Fig. 3, C and D). We have termed these structures “protofibrils” to distinguish them from the mature, amyloid-type fibers found in the pellets. Low molecular weight oligomers (larger than dimers) were not detected in the prior SEC experiments. Oligomerization could be thermodynamically unfavorable or be suppressed kinetically due to rapid consumption of precursor by growing fibrils. Fibril formation would be accelerated by the presence of pre-existing aggregates (seeds) in the starting material. Freshly prepared solutions of Aβ-(1–40) did, in fact, contain high molecular weight species that might act as seeds (Fig. 2 A). To determine if rapid fibril formation affected Aβ oligomerization, we sought to eliminate seeds prior to our experiments by dissolving Aβ in HFIP, lyophilizing the solution, dissolving the lyophilizate in Me2SO, and then filtering the solution through a filter containing 20-nm pores. The chromatographic behavior of peptides “deseeded” in this way did not differ from that of peptides prepared without deseeding (data not shown). An included peak was observed initially, which was replaced over time by a peak in the void volume of the column. These data suggest that formation of stable low molecular weight oligomers is a relatively unfavored process. Our results suggested that, if present, steady state levels of oligomeric fibril precursors would be extremely low, making their detection by UV absorbance difficult. For this reason, two sensitive methods were utilized to monitor Aβ polymerization: 1) radioiodinated peptide was used as a tracer in mixtures with unlabeled peptide; and 2) SEC fractions were assayed for Aβ content by RIA. Radioiodinated Aβ-(1–40) (125I-Aβ-(1–40); 100 pm final concentration) was mixed with unlabeled Aβ (1 mg/ml) in 0.1m Tris-HCl, pH 7.4, chromatographed on a Superdex 75 column, and detected in column fractions by scintillation counting. At 0 h, a single peak was observed coincident with unlabeled Aβ (Fig. 4). After incubation at room temperature for 8 or 24 h, an additional peak of radioactivity was detected in the void volume (Fig. 4; at ∼7.4 ml). The radioactivity and UV absorbance of this peak increased at the same rate over time, suggesting that the labeled and unlabeled peptides polymerized in an analogous manner. In the above experiment, given that ∼33,000 cpm of Aβ were used, oligomers representing as little as 1% of the initial protein mass could have been detected. Asymmetry in the void and dimer peaks, indicated by trailing and leading shoulders, respectively, mirrored the behavior of the unlabeled peptide (cf. Figs. 1 and 4). RIA analysis of Aβ-(1–40) SEC fractions produced using the same protocol as above yielded results similar to those presented in Fig. 4 (data not shown). Experiments were also performed at much lower Aβ concentrations by using tracer alone; however, below 10−5

Alzheimer's disease is characterized by extensive cerebral amyloid deposition. Amyloid deposits associated with damaged neuropil and blood vessels contain abundant fibrils formed by the amyloid β-protein (Aβ). Fibrils, both in vitro and in vivo, are neurotoxic. For this reason, substantial effort has been expended to develop therapeutic approaches to control Aβ production and amyloidogenesis. Achievement of the latter goal is facilitated by a rigorous mechanistic understanding of the fibrillogenesis process. Recently, we discovered a novel intermediate in the pathway of Aβ fibril formation, the amyloid protofibril (Walsh, D. M., Lomakin, A., Benedek, G. B., Condron, M. M., and Teplow, D. B. (1997) J. Biol. Chem. 272, 22364–22372). We report here results of studies of the assembly, structure, and biological activity of these polymers. We find that protofibrils: 1) are in equilibrium with low molecular weight Aβ (monomeric or dimeric); 2) have a secondary structure characteristic of amyloid fibrils; 3) appear as beaded chains in rotary shadowed preparations examined electron microscopically; 4) give rise to mature amyloid-like fibrils; and 5) affect the normal metabolism of cultured neurons. The implications of these results for the development of therapies for Alzheimer's disease and for our understanding of fibril assembly are discussed. Alzheimer's disease is characterized by extensive cerebral amyloid deposition. Amyloid deposits associated with damaged neuropil and blood vessels contain abundant fibrils formed by the amyloid β-protein (Aβ). Fibrils, both in vitro and in vivo, are neurotoxic. For this reason, substantial effort has been expended to develop therapeutic approaches to control Aβ production and amyloidogenesis. Achievement of the latter goal is facilitated by a rigorous mechanistic understanding of the fibrillogenesis process. Recently, we discovered a novel intermediate in the pathway of Aβ fibril formation, the amyloid protofibril (Walsh, D. M., Lomakin, A., Benedek, G. B., Condron, M. M., and Teplow, D. B. (1997) J. Biol. Chem. 272, 22364–22372). We report here results of studies of the assembly, structure, and biological activity of these polymers. We find that protofibrils: 1) are in equilibrium with low molecular weight Aβ (monomeric or dimeric); 2) have a secondary structure characteristic of amyloid fibrils; 3) appear as beaded chains in rotary shadowed preparations examined electron microscopically; 4) give rise to mature amyloid-like fibrils; and 5) affect the normal metabolism of cultured neurons. The implications of these results for the development of therapies for Alzheimer's disease and for our understanding of fibril assembly are discussed. Alzheimer's disease amyloid β-protein amyloid β-protein precursor size exclusion chromatography low molecular weight amino acid analysis quasielastic light scattering spectroscopy thioflavin T 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide atomic force microscopy Alzheimer's disease (AD)1 is a progressive neurodegenerative disorder defined histologically by the formation in the brain of intracellular neurofibrillary tangles and extracellular amyloid deposits (1Alzheimer A. Neurol. Centr. 1906; 23: 1129-1136Google Scholar). Particular attention has been focused on the role that the amyloid β-protein (Aβ), the primary protein constituent of amyloid deposits, plays in development of AD. Aβ molecules are fibrillogenic and exist in a number of forms in vivo (2Teplow D.B. Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest. 1998; 5: 121-142Crossref PubMed Scopus (289) Google Scholar). Among those forms found in amyloid deposits, 40 and 42 residue long species (Aβ(1–40) and Aβ(1–42), respectively) are particularly important. Genetic studies of AD have shown that mutations in the gene encoding the precursor of Aβ (the amyloid β-protein precursor (βAPP) gene) (3Chartier-Harlin M.-C. Crawford F. Houlden H. Nature. 1991; 353: 844-846Crossref PubMed Scopus (1064) Google Scholar, 4Goate A. Chartier-Harlin M.-C. Mullan M. Brown J. Crawford F. Fidani L. Giuffra L. Haynes A. Irving N. James L. Mant R. Newton P. Rooke K. Roques P. Talbot C. Pericak-Vance M. Roses A. Williamson R. Rossor M. Owen M. Hardy J. Nature. 1991; 349: 704-706Crossref PubMed Scopus (3789) Google Scholar, 5Mullan M. Crawford F. Houlden H. Axelman K. Lilius L. Winblad B. Lannfelt L. Nat. Genet. 1992; 1: 345-347Crossref PubMed Scopus (1192) Google Scholar, 6Eckman C.B. Mehta N.D. Crook R. Perez-Tur J. Prihar G. Pfeiffer E. Graff-Radford N. Hinder P. Yager D. Zenk B. Refolo L.M. Prada C.M. Younkin S.G. Hutton M. Hardy J. Human Mol. Genet. 1997; 6: 2087-2089Crossref PubMed Scopus (185) Google Scholar), or in genes that regulate the proteolytic processing of βAPP (7Levy-Lahad E. Wijsman E.M. Nemens E. Anderson L. Goddard K.A.B. Weber J.L. Bird T.D. Schellenberg G.D. Science. 1995; 269: 970-973Crossref PubMed Scopus (694) Google Scholar, 8Levy-Lahad E. Wasco W. Poorkaj P. Romano D.M. Oshima J. Pettingell W.H., Yu, C.E. Jondro P.D. Schmidt S.D. Wang K. Crowley A.C. Fu Y.H. Guenette S.Y. Galas D. Nemens E. Wijsman E.M. Bird T.D. Schellenberg G.D. Tanzi R.E. Science. 1995; 269: 973-977Crossref PubMed Scopus (2230) Google Scholar, 9Sherrington R. Rogaev E.I. Liang Y. Rogaeva E.A. Levesque G. Ikeda M. Chi H. Lin C. Li G. Holman K. Tsuda T. Mar L. Foncin J.F. Bruni A.C. Montesi M.P. Sorbi S. Rainero I. Pinessi L. Nee L. Chumakov I. Pollen D. Brookes A. Sanseau P. Polinsky R.J. Wasco W. Da Silva H.A.R. Haines J.L. Pericak-Vance M.A. Tanzi R.E. Roses A.D. Fraser P.E. Rommen J.M. St. George-Hyslop P.H. Nature. 1995; 375: 754-760Crossref PubMed Scopus (3585) Google Scholar), cause AD. The phenotypic effects of these mutations show remarkable consistency, they all result in excessive production of Aβ or in an increased Aβ(1–42)/Aβ(1–40) ratio, facilitating amyloid deposition (10Selkoe D.J. Science. 1997; 275: 630-631Crossref PubMed Scopus (848) Google Scholar, 11Hardy J. Trends Neurosci. 1997; 20: 154-159Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1275) Google Scholar). In addition, specific haplotypes and mutations in genes involved in the extracellular transport or cleavage of Aβ are risk factors for AD (12Corder E.H. Saunders A.M. Strittmatter W.J. Schmechel D.E. Gaskell P.C. Small G.W. Roses A.D. Haines J.L. Pericak-Vance M.A. Science. 1993; 261: 921-923Crossref PubMed Scopus (7296) Google Scholar, 13Blacker D. Wilcox M.A. Laird N.M. Rodes L. Horvath S.M. Go R.C. Perry R. Watson Jr., B. Bassett S.S. McInnis M.G. Albert M.S. Hyman B.T. Tanzi R.E. Nat. Genet. 1998; 19: 357-360Crossref PubMed Scopus (584) Google Scholar).In vitro and in vivo studies of Aβ toxicity indicate that fibrillar Aβ can directly kill neurons or initiate a cascade of events leading to neuronal cell death (14Mattson M.P. Physiol. Rev. 1997; 77: 1081-1132Crossref PubMed Scopus (878) Google Scholar, 15Geula C. Wu C.K. Saroff D. Lorenzo A. Yuan M.L. Yankner B.A. Nature Med. 1998; 4: 827-831Crossref PubMed Scopus (502) Google Scholar, 16McKee A.C. Kowall N.W. Schumacher J.S. Beal M.F. Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest. 1998; 5: 1-9Crossref PubMed Scopus (56) Google Scholar). For this reason, therapeutic strategies targeting Aβ fibrillogenesis are being pursued actively (17Soto C. Sigurdsson E.M. Morelli L. Kumar R.A. Castano E.M. Frangione B. Nature Med. 1998; 4: 822-826Crossref PubMed Scopus (800) Google Scholar, 18Schenk D.B. Rydel R.E. May P. Little S. Panetta J. Lieberburg I. Sinha S. J. Med. Chem. 1995; 38: 4141-4154Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar, 19Ghanta J. Shen C.L. Kiessling L.L. Murphy R.M. J. Biol. Chem. 1996; 271: 29525-29528Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (211) Google Scholar, 20Tjernberg L.O. Naslund J. Lindqvist F. Johansson J. Karlstrom A.R. Thyberg J. Terenius L. Nordstedt C. J. Biol. Chem. 1996; 271: 8545-8548Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (840) Google Scholar). Unfortunately, key areas of Aβ fibrillogenesis are poorly understood. In particular, the three-dimensional structure and organization of fibril subunits are unknown, as are the steps involved in assembly of nascent, monomeric Aβ first into nuclei, then into higher order oligomers and polymers. Identification of structural intermediates in the fibrillogenesis process and elucidation of the thermodynamics of the associated conformational changes in, and assembly of, Aβ will facilitate identification of therapeutic targets. Rigorous biophysical studies of fibrillogenesis require well characterized, homogeneous starting peptide preparations, free of pre-existing fibrillar material, particulates, or other types of fibril seeds. In prior studies, synthetic Aβ has been dissolved in water or in organic solvents, then diluted directly into buffer for use (21Jarrett J.T. Berger E.P. Lansbury Jr., P.T. Biochemistry. 1993; 32: 4693-4697Crossref PubMed Scopus (1760) Google Scholar, 22Harper J.D. Wong S.S. Lieber C.M. Lansbury P.T. Chem. Biol. 1997; 4: 119-125Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (626) Google Scholar, 23Howlett D.R. Jennings K.H. Lee D.C. Clark M.S. Brown F. Wetzel R. Wood S.J. Camilleri P. Roberts G.W. Neurodegeneration. 1995; 4: 23-32Crossref PubMed Scopus (188) Google Scholar, 24Wood S.J. Maleeff B. Hart T. Wetzel R. J. Mol. Biol. 1996; 256: 870-877Crossref PubMed Scopus (341) Google Scholar). It has been demonstrated that when synthetic Aβ peptides are resuspended at neutral pH they contain a heterogeneous mixture of different sized species (25Snyder S.W. Ladror U.S. Wade W.S. Wang G.T. Barrett L.W. Matayoshi E.D. Huffaker H.J. Krafft G.A. Holzman T.F. Biophys. J. 1994; 67: 1216-1228Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (348) Google Scholar, 26Walsh D.M. Lomakin A. Benedek G.B. Condron M.M. Teplow D.B. J. Biol. Chem. 1997; 272: 22364-22372Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (948) Google Scholar). In some cases, attempts to physically “de-seed” stock peptide solutions have been made (21Jarrett J.T. Berger E.P. Lansbury Jr., P.T. Biochemistry. 1993; 32: 4693-4697Crossref PubMed Scopus (1760) Google Scholar). However, in most studies, either no precautions were taken or filtration through 0.2-μm filters, incapable of removing anything other than large aggregates, was used. The use of these solutions complicates data interpretation and precludes the study of the earliest phases of fibrillogenesis in vitro. We recently demonstrated that size exclusion chromatography (SEC) can be used to prepare homogeneous populations of Aβ, termed low molecular weight Aβ (LMW Aβ), which are composed of monomeric or dimeric Aβ molecules (26Walsh D.M. Lomakin A. Benedek G.B. Condron M.M. Teplow D.B. J. Biol. Chem. 1997; 272: 22364-22372Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (948) Google Scholar). Using these preparations to study Aβ fibrillogenesis, we discovered and reported the initial characterization of a new fibrillogenesis intermediate, the amyloid protofibril (26Walsh D.M. Lomakin A. Benedek G.B. Condron M.M. Teplow D.B. J. Biol. Chem. 1997; 272: 22364-22372Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (948) Google Scholar). This intermediate was also described independently by Harper et al. (22Harper J.D. Wong S.S. Lieber C.M. Lansbury P.T. Chem. Biol. 1997; 4: 119-125Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (626) Google Scholar). Protofibrils are short, flexible fibrils, generally 4–10 nm in diameter and up to 200 nm in length, as measured by negative staining and electron microscopy. Protofibrils appear transiently during Aβ fibrillogenesis (26Walsh D.M. Lomakin A. Benedek G.B. Condron M.M. Teplow D.B. J. Biol. Chem. 1997; 272: 22364-22372Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (948) Google Scholar, 27Harper J.D. Lieber C.M. Lansbury P.T. Chem. Biol. 1997; 4: 951-959Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (414) Google Scholar). Evidence suggests that protofibrils are precursors of the longer, more rigid, amyloid-type fibrils typically produced in vitro using synthetic peptides (22Harper J.D. Wong S.S. Lieber C.M. Lansbury P.T. Chem. Biol. 1997; 4: 119-125Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (626) Google Scholar, 26Walsh D.M. Lomakin A. Benedek G.B. Condron M.M. Teplow D.B. J. Biol. Chem. 1997; 272: 22364-22372Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (948) Google Scholar). If an analogous fibril maturation mechanism operates in vivo, the protofibril stage could be an important therapeutic focus. This may, in fact, be the case as soluble oligomeric forms of Aβ have been isolated from human AD brain (28Kuo Y.M. Emmerling M.R. Vigo-Pelfrey C. Kasunic T.C. Kirkpatrick J.B. Murdoch G.H. Ball M.J. Roher A.E. J. Biol. Chem. 1996; 271: 4077-4081Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (555) Google Scholar). We report here results of studies which significantly extend our knowledge of protofibril morphology, the kinetics and equilibria of protofibril formation and disappearance, the secondary structure of protofibrils and their LMW Aβ precursors, and the biological activity of protofibrils. Our findings suggest that in developing therapies targeting Aβ toxicity, consideration must be given not only to the effects of mature, amyloid-type fibrils, but also to those of protofibrils, and potentially, protofibril precursors. Chemicals were obtained from Sigma and were of the highest purity available. Water was double-distilled and deionized using a Milli-Q system (Millipore Corp., Bedford, MA). Tissue culture components were obtained from Life Technologies, Inc. (Grand Island, NY). Aβ(1–40) was synthesized and purified in our laboratory as described (26Walsh D.M. Lomakin A. Benedek G.B. Condron M.M. Teplow D.B. J. Biol. Chem. 1997; 272: 22364-22372Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (948) Google Scholar). Peptide mass, purity, and quantity were determined by a combination of matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, analytical high performance liquid chromatography, and quantitative amino acid analysis (AAA). Purified peptides were aliquoted, lyophilized, and stored at −20 °C until used. Aβ(1–40) was also obtained from Bachem (Torrance, CA) and Quality Controlled Biochemicals (Hopkington, MA). Estimates of peptide content were provided by each manufacturer. Iodinated Aβ(1–40) (125I-Aβ(1–40); ∼2000 Ci/mmol in 35% (v/v) acetonitrile, 0.1% (v/v) trifluoroacetic acid) was generously provided by Dr. Evelyn R. Stimson, University of Cincinnati College of Medicine. A Superdex 75 HR 10/30 column (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) was attached either to a Waters 650 Advanced Protein Purification system, consisting of a Waters 650 controller and pump, a Rheodyne 9125 injector, a Waters 484 tunable absorbance detector, and a Waters 745 data module, or to a Beckman 110B solvent delivery system module 406 and System Gold detector module 166. In this work, the term “low molecular weight Aβ” (LMW Aβ) signifies an Aβ species which elutes from a SEC column as a single peak and has a hydrodynamic radius consistent with that of either an extended monomer or a compact dimer (determined by quasielastic light scattering spectroscopy (QLS) to be 1–2 nm) (26Walsh D.M. Lomakin A. Benedek G.B. Condron M.M. Teplow D.B. J. Biol. Chem. 1997; 272: 22364-22372Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (948) Google Scholar). To isolate LMW Aβ, Aβ(1–40) was dissolved at a concentration of 2 mg/ml in dimethyl sulfoxide and sonicated in a Branson 1200 ultrasonic water bath for 10 min, after which 200 μl of this solution were injected into the SEC column. The column was eluted with 0.05 m Tris-HCl, pH 7.4, containing 0.02% (w/v) sodium azide, at a flow rate of 0.5 ml/min. Peptides were detected by UV absorbance at 254 nm, and 350-μl volume fractions were collected during elution of the LMW Aβ peak. Pre-dissolution of Aβ in either dimethyl sulfoxide or buffer gave essentially the same results with respect to SEC and subsequent QLS and circular dichroism spectroscopy (CD) analysis, but dimethyl sulfoxide treatment significantly increased the recovery of peptide. Protofibrils were prepared essentially as described (26Walsh D.M. Lomakin A. Benedek G.B. Condron M.M. Teplow D.B. J. Biol. Chem. 1997; 272: 22364-22372Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (948) Google Scholar). Briefly, 400 μg of Aβ(1–40) were dissolved in 100 μl of water, diluted with an equal volume of 0.2m Tris-HCl, pH 7.4, containing 0.04% (w/v) sodium azide, then incubated at room temperature for 40–60 h. The yield of protofibrils varied among different peptide lots, but a 1–2-day incubation period generally yielded equivalent amounts of protofibrils and LMW Aβ. Following incubation, the solution was centrifuged at 16,000 × g (measured at tube bottom) for 5 min, then ∼160 μl of the supernate were fractionated by SEC, as described above. This procedure yields a symmetric peak in the void volume of the column (Mr > 30,000 for dextrans) which contained protofibrils and a peak of LMW Aβ in the included volume (26Walsh D.M. Lomakin A. Benedek G.B. Condron M.M. Teplow D.B. J. Biol. Chem. 1997; 272: 22364-22372Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (948) Google Scholar). Electron microscopic examination of the assemblies in the void peak have revealed small globular structures ∼5 nm in diameter and rods with lengths up to ∼200 nm. Based on a 4–5-nm diameter rod and a linear density of Aβ molecules of 0.8 nm−1 (29Lomakin A. Chung D.S. Benedek G.B. Kirschner D.A. Teplow D.B. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 1125-1129Crossref PubMed Scopus (733) Google Scholar), the molecular masses of these assemblies would range from ∼25 to 900 kDa. Samples were prepared for electron microscopy (EM) using both negative contrast and rotary shadowing techniques. Preparation of samples for negative contrast was performed as described (26Walsh D.M. Lomakin A. Benedek G.B. Condron M.M. Teplow D.B. J. Biol. Chem. 1997; 272: 22364-22372Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (948) Google Scholar). Briefly, sample was applied to a carbon-coated Formvar grid, fixed with a solution of glutaraldehyde, then stained with uranyl acetate. Samples were observed using a JEOL 1200 EX transmission electron microscope. For rotary shadowing, casts of samples were prepared essentially as described (30San Antonio J.D. Lander A.D. Karnovsky M.J. Slayter H.S. J. Cell Biol. 1994; 125: 1179-1188Crossref PubMed Scopus (95) Google Scholar). 100-μl aliquots of protofibril fractions were first diluted in 5 mmimidazole, 50 mm NaCl, to ∼1 ml and then diluted with 2 volumes of freshly distilled glycerol. The resulting solution was sprayed onto newly cleaved mica sheets and rotary shadowed using a Denton vacuum evaporator and a platinum source such that an ∼1 nm thick sheet of platinum was deposited on the mica. Following this treatment, a thin carbon film was deposited on top of the platinum. The replica was floated off on water and picked up with a 400-mesh copper grid and examined using a JEOL 100 CX transmission electron microscope. 400 μg of Aβ(1–40) were dissolved in 20 μl of dimethyl sulfoxide, to which was added 10 μl of 125I-Aβ(1–40). This mixture was then diluted with 70 μl of water, 100 μl of 0.2 mTris-HCl, pH 7.4, containing 0.04% (w/v) sodium azide, and then incubated at room temperature for 48–60 h. Following incubation, the solution was centrifuged at 16,000 × g for 5 min and 160 μl of supernate fractionated by SEC, as described above. 200-μl aliquots of the LMW Aβ and protofibril fractions were placed in 1-ml sterile Spectra/Por CE DispoDialyzers (Spectrum Scientific, Laguna Hills, CA) and dialyzed with gentle stirring at room temperature versus 20 ml of 0.05 m Tris-HCl, pH 7.4, containing 0.02% (w/v) sodium azide. In addition, other aliquots of the SEC fractions were used for negative contrast EM, AAA, and scintillation counting. To ensure that the 125I-Aβ was accurately tracing the cold peptide, all SEC fractions were subjected to scintillation counting and the radiotracer profile compared with the UV chromatogram. Only samples which showed a similar distribution of radiolabel and UV absorbance were used. In order to monitor the release of LMW 125I-Aβ(1–40) from the dialysis bag, 1-ml aliquots of dialysis buffer were removed and counted. The aliquots were returned to the dialysis chamber after counting (normally <5 min after their removal). At the end of the experiment, the bag was removed, counted, and a sample of the contents taken for negative contrast EM. QLS was performed as described previously (26Walsh D.M. Lomakin A. Benedek G.B. Condron M.M. Teplow D.B. J. Biol. Chem. 1997; 272: 22364-22372Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (948) Google Scholar). Briefly, measurements were performed at 25 °C using a Langley Ford model 1097 autocorrelator and a Coherent argon ion laser (Model Innova 90-plus) tuned to 514 nm. LMW Aβ and protofibrils were isolated as described above. To avoid interference from dust, QLS tubes were washed in a continual flow of eluent from a Superdex 75 column and LMW Aβ or protofibril material were collected directly into these tubes by displacement (31Lomakin A. Benedek G.B. Teplow D.B. Methods Enzymol. 1999; 309 (in press)PubMed Google Scholar). The tubes were then heat-sealed and QLS monitoring begun, usually within 2–5 min of collection. Fibrils were prepared by dissolving 800 μg of Aβ(1–40) in 200 μl of water and then diluting with an equal volume of 0.2 m Tris-HCl, pH 7.4, containing 0.04% (w/v) sodium azide. This solution was incubated for 5 days at 37 °C, then thoroughly mixed, diluted with an equal volume of water, and an aliquot examined by EM to confirm the presence of mature fibrils. The remaining solution was serially diluted to yield concentrations of approximately 500, 250, 125, 62, 31, and 16 μg/ml in 0.05 m Tris-HCl, pH 7.4. Standards were used immediately or stored at −20 °C until required. The concentrations of the standards were determined by AAA. Congo red binding was assessed essentially as described by Klunk et al. (32Klunk W.E. Pettegrew J.W. Abraham D.J. J. Histochem. Cytochem. 1989; 37: 1273-1281Crossref PubMed Scopus (568) Google Scholar), but with volumes adjusted to perform the assay in a microtiter plate. Briefly, 225 μl of 20 μm Congo red in 20 mmpotassium phosphate, pH 7.4, containing 0.15 m sodium chloride, was added to 25 μl of sample, mixed, and incubated for 30 min at room temperature. The absorbance of the resulting solutions was then measured at 480 and 540 nm using a Molecular Devices Thermo Max microplate reader. All samples were assessed in triplicate and the amount of Congo red bound (Cb) calculated using the formula Cb (nm) = [(A540/25,295) − (A480/46,306)] × 103. The Cb values shown were obtained after subtraction of Cb values for buffer alone. Thioflavin T (ThT) binding was assessed as described by Naiki and Nakakuki (33Naiki H. Nakakuki K. Lab. Invest. 1996; 74: 374-383PubMed Google Scholar). 100 μl of sample was added to a 1-cm path length cuvette containing 800 μl of water and 1 ml of 100 mm glycine-NaOH, pH 8.5. The reaction was then initiated by the addition of 50 μl of 100 μm ThT in water and the solution vortexed briefly. Fluorescence was measured after 90, 100, 110, and 120 s. Measurements were made using a Perkin-Elmer LS-5B Luminescence spectrometer with excitation and emission wavelengths of 446 nm (slit width = 5 nm) and 490 nm (slit width = 10 nm), respectively. Each sample and standard was done in triplicate. Solutions of protofibrils or LMW Aβ isolated by SEC were placed into 1-mm path length quartz cuvettes (Hellma, Forest Hills, NY) and spectra obtained from ∼195–250 nm at room temperature using an Aviv 62A DS spectropolarimeter. Raw data were manipulated by smoothing and subtraction of buffer spectra, according to the manufacturer's instructions. Deconvolution of the resulting spectra was achieved using the program CDANAL (34Perczel A. Park K. Fasman G.D. Anal. Biochem. 1992; 203: 83-93Crossref PubMed Scopus (421) Google Scholar) and the Brahms and Brahms reference library (35Brahms S. Brahms J. J. Mol. Biol. 1980; 138: 149-178Crossref PubMed Scopus (712) Google Scholar). The relative amounts of random coil, α-helix, β-sheet, and β-turn in each sample were determined from the normalized contribution of each secondary structure element function to the observed spectrum following curve fitting. LMW Aβ and protofibrils were prepared by SEC. Briefly, 1 mg of peptide was dissolved in 250 μl of water containing 0.01% (v/v) phenol red, diluted with an equal volume of 0.2m Tris-HCl, pH 7.4, then incubated at room temperature for 2 days. Solutions were then centrifuged at 16,000 × g for 5 min and 400–440 μl of the supernate fractionated on a Superdex 75 column eluted with 5 mm Tris-HCl, pH 7.4, 70 mm NaCl, at 0.5 ml/min. The elution solvent was chosen empirically after preliminary experiments showed that 0.05m Tris buffer was toxic to cultured neurons and that LMW Aβ and protofibril yields were unacceptably low in the absence of salt. The Tris/NaCl system produced chromatograms indistinguishable from those seen using 0.05 m Tris-HCl, pH 7.4. In addition, the morphology and hydrodynamic radii of protofibrils prepared by this method were essentially the same as those obtained using 0.05m Tris buffer. Peptides were detected by UV absorbance at 254 nm and 450-μl fractions were collected during elution of the LMW Aβ and protofibril peaks. Fractions used for studies of biological activity were also subjected to AAA and EM. In attempting to produce fibrils, we found that when Aβ(1–40) (from a variety of sources) was dissolved at >1 mg/ml in water, it produced a solution whose pH (<3) could not be adjusted properly with 5 mm Tris buffer. To overcome this problem and facilitate monitoring of the pH under sterile conditions, peptide was suspended initially at ∼3.2 mg/ml in 1 mm NaOH, containing 0.01% (v/v) phenol red. 10 mm NaOH then was added at the empirically determined ratio of 200 μl/mg of peptide. This ratio varied slightly among different peptide lots. Finally, the solution was diluted sequentially with 100 mm Tris-HCl, pH 7.4, containing 1.4 m NaCl, and water to give a concentration of ∼1.6 mg/ml Aβ(1–40) in 5 mm Tris-HCl, pH 7.4, containing 70 mm NaCl. These solutions were incubated for 2 days at 37 °C, and then used. This procedure consistently produced solutions of amyloid fibrils which could be sedimented readily by brief centrifugation (16,000 × g, 5 min) and which were indistinguishable from those formed by incubation in 50 mmTris-HCl, pH 7.4. Rat primary cortical neurons were prepared according to Hartley et al. (36Hartley D.M. Kurth M.C. Bjerkness L. Weiss J.H. Choi D.W. J. Neurosci. 1993; 13: 1993-2000Crossref PubMed Google Scholar), with slight modifications. Briefly, brain cells were isolated from the neocortex of E15-17 rat embryos and plated onto poly-l-lysine coated 96-well plates at a density of 2 × 104 cells/well in Dulbecco's minimal essential medium containing 5% (v/v) bovine calf serum, 10% (v/v) Ham's F-12, HEPES (20 mm),l-glutamine (2 mm), and penicillin-streptomycin (500 units/ml and 500 μg/ml, respectively). Cultures were used 2–4 days after plating. Cell-mediated reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) was assessed according to the method of Hansen et al. (37Hansen M.B. Nielsen S.E. Berg K. J. Immunol. Methods. 1989; 119: 203-210Crossref PubMed Scopus (3343) Google Scholar). Freshly isolated protofibrils or LMW Aβ fractions were mixed with concentrated stock solutions of individual tissue culture components to produce a final solution containing 10 mm glucose, 500 units/ml penicillin, 500 μg/ml streptomycin, 20 mm HEPES, and 26 mm NaCO3, all in 1 × minimal essential medium. Peptide concentrations were determined prior to this supplementation. Fibril standards were prepared in a similar fashion to yield nominal final peptide concentrations of 5, 10, and 15 μm. Cells were incubated either in 50 μl of medium without Aβ or in 50 μl containing fibrillar Aβ, protofibrils, or LMW Aβ. After 2 h, 10 μl of 2.5 mg/ml MTT was added to each well and the incubation continued for a further 3 h. Cells were then solubilized in 200 μl of 20% (w/v) SDS in 50% (v/v)N,N′-dimethylformamide, 25 mm HCl, 2% (v/v) glacial acetic acid, pH 4.7, by overnight incubation at 37 °C. Levels of reduced MTT were determined by measuring the difference in absorbance at 595 and 650 nm using a Molecular Devices Thermo Max microplate reader. The effects of treatments were compared with controls by using the one-way analysis of variance Tukey test. No reduction of MTT was observed in fibril controls (even at a concentration of ∼30 μm) in the absence of cells. Previous studies of protofibril morphology utilizing negative staining and EM (26Walsh D.M. Lomakin A. Benedek G.B. Condron M.M. Teplow D.B. J. Biol. Chem. 1997; 272: 22364-22372Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (948) Google Scholar), or AFM (22Harper J.D. Wong S.S. Lieber C.M. Lansbury P.T. Chem. Biol. 1997; 4: 119-125Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (626) Google Scholar, 27Harper J.D. Lieber C.M. Lansbury P.T. Chem. Biol. 1997; 4: 951-959Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (414) Google Scholar), required avid macromolecule adherence to the sample support for their success. If certain structures were washed away during preparation of the supports, potentially important species would not be observed. To address this issue, and to further our efforts at understanding the gross morphology of protofibrils, we performed electron microscopic examination of protofibrils prepared by rotatory shadowing. In this procedure, which involves no washing, a thin, uniform film of sample is sprayed onto a mica support from which shadow casts are then generated and examined. Both shadowed and negatively stained protofibrils appeared as flexible rods of length up to ∼200 nm

In recent years, small protein oligomers have been implicated in the aetiology of a number of important amyloid diseases, such as type 2 diabetes, Parkinson's disease and Alzheimer's disease. As a consequence, research efforts are being directed away from traditional targets, such as amyloid plaques, and towards characterization of early oligomer states. Here we present a new analysis method, ion mobility coupled with mass spectrometry, for this challenging problem, which allows determination of in vitro oligomer distributions and the qualitative structure of each of the aggregates. We applied these methods to a number of the amyloid-β protein isoforms of Aβ40 and Aβ42 and showed that their oligomer-size distributions are very different. Our results are consistent with previous observations that Aβ40 and Aβ42 self-assemble via different pathways and provide a candidate in the Aβ42 dodecamer for the primary toxic species in Alzheimer's disease. Ion-mobility mass spectrometry has been used to identify and characterize the oligomeric assemblies of amyloid-β proteins under physiologically relevant conditions. Hexamers and dodecamers are formed only from Aβ42 proteins and the dodecamer is identified as a candidate for the primary toxic agent in the development of Alzheimer's disease.

Amyloid β-protein (Aβ) oligomers may be the proximate neurotoxins in Alzheimer's disease (AD). “Oligomer” is an ill-defined term because many kinds have been reported and they often exist in rapid equilibrium with monomers and higher-order assemblies. We report here results of studies in which specific oligomers have been stabilized structurally, fractionated in pure form, and then studied by using a combination of CD spectroscopy, Thioflavin T fluorescence, EM, atomic force microscopy (AFM), and neurotoxicity assays. Aβ monomers were largely unstructured, but oligomers exhibited order-dependent increases in β-sheet content. EM and AFM data suggest that dimerization and subsequent monomer addition are processes in which significant and asymmetric monomer conformational changes occur. Oligomer secondary structure and order correlated directly with fibril nucleation activity. Neurotoxic activity increased disproportionately (order dependence >1) with oligomer order. The structure–activity correlations reported here significantly extend our understanding of the conformational dynamics, structure, and relative toxicity of pure Aβ oligomers of specific order.

Amyloid β-protein (Aβ) assembly into toxic oligomeric and fibrillar structures is a seminal event in Alzheimer’s disease, therefore blocking this process could have significant therapeutic benefit. A rigorous mechanistic understanding of Aβ assembly would facilitate the targeting and design of fibrillogenesis inhibitors. Prior studies have shown that Aβ fibrillogenesis involves conformational changes leading to the formation of extended β-sheets and that an α-helix-containing intermediate may be involved. However, the significance of this intermediate has been a matter of debate. We report here that the formation of an oligomeric, α-helix-containing assembly is a key step in Aβ fibrillogenesis. The generality of this phenomenon was supported by conformational studies of 18 different Aβ peptides, including wild-type Aβ(1–40) and Aβ(1–42), biologically relevant truncated and chemically modified Aβ peptides, and Aβ peptides causing familial forms of cerebral amyloid angiopathy. Without exception, fibrillogenesis of these peptides involved an oligomeric α-helix-containing intermediate and the kinetics of formation of the intermediate and of fibrils was temporally correlated. The kinetics varied depending on amino acid sequence and the extent of peptide N- and C-terminal truncation. The pH dependence of helix formation suggested that Asp and His exerted significant control over this process and over fibrillogenesis in general. Consistent with this idea, Aβ peptides containing Asp → Asn or His → Gln substitutions showed altered fibrillogenesis kinetics. These data emphasize the importance of the dynamic interplay between Aβ monomer conformation and oligomerization state in controlling fibrillogenesis kinetics.

The presenilin (PS)‐dependent site 3 (S3) cleavage of Notch liberates its intracellular domain (NICD), which is required for Notch signaling. The similar γ‐secretase cleavage of the β‐amyloid precursor protein (βAPP) results in the secretion of amyloid β‐peptide (Aβ). However, little is known about the corresponding C‐terminal cleavage product (CTFγ). We have now identified CTFγ in brain tissue, in living cells, as well as in an in vitro system. Generation of CTFγ is facilitated by PSs, since a dominant‐negative mutation of PS as well as a PS gene knock out prevents its production. Moreover, γ‐secretase inhibitors, including one that is known to bind to PS, also block CTFγ generation. Sequence analysis revealed that CTFγ is produced by a novel γ‐secretase cut, which occurs at a site corresponding to the S3 cleavage of Notch.