Background— Cardiomyocytes derived from human embryonic stem (hES) cells could be useful in restoring heart function after myocardial infarction or in heart failure. Here, we induced cardiomyocyte differentiation of hES cells by a novel method and compared their electrophysiological properties and coupling with those of primary human fetal cardiomyocytes. Methods and Results— hES cells were cocultured with visceral-endoderm (VE)–like cells from the mouse. This initiated differentiation to beating muscle. Sarcomeric marker proteins, chronotropic responses, and ion channel expression and function were typical of cardiomyocytes. Electrophysiology demonstrated that most cells resembled human fetal ventricular cells. Real-time intracellular calcium measurements, Lucifer yellow injection, and connexin 43 expression demonstrated that fetal and hES-derived cardiomyocytes are coupled by gap junctions in culture. Inhibition of electrical responses by verapamil demonstrated the presence of functional α 1c -calcium ion channels. Conclusions— This is the first demonstration of induction of cardiomyocyte differentiation in hES cells that do not undergo spontaneous cardiogenesis. It provides a model for the study of human cardiomyocytes in culture and could be a step forward in the development of cardiomyocyte transplantation therapies.

Human embryonic stem cells differentiate spontaneously in vitro into a range of cell types, and they frequently give rise to cells with the properties of extra-embryonic endoderm. We show here that endogenous signaling by bone morphogenetic protein-2 controls the differentiation of embryonic stem cells into this lineage. Treatment of embryonic stem cell cultures with the bone morphogenetic protein antagonist noggin blocks this form of differentiation and induces the appearance of a novel cell type that can give rise to neural precursors. These findings indicate that bone morphogenetic protein-2 controls a key early commitment step in human embryonic stem cell differentiation, and show that the conservation of developmental mechanisms at the cellular level can be exploited in this system – in this case, to provide a facile route for the generation of neural precursors from pluripotent cells.

Defined growth conditions are essential for many applications of human embryonic stem cells (hESC). Most defined media are presently used in combination with Matrigel, a partially defined extracellular matrix (ECM) extract from mouse sarcoma. Here, we defined ECM requirements of hESC by analyzing integrin expression and ECM production and determined integrin function using blocking antibodies. hESC expressed all major ECM proteins and corresponding integrins. We then systematically replaced Matrigel with defined medium supplements and ECM proteins. Cells attached efficiently to natural human vitronectin, fibronectin, and Matrigel but poorly to laminin + entactin and collagen IV. Integrin-blocking antibodies demonstrated that alphaVbeta5 integrins mediated adhesion to vitronectin, alpha5beta1 mediated adhesion to fibronectin, and alpha6beta1 mediated adhesion to laminin + entactin. Fibronectin in feeder cell-conditioned medium partially supported growth on all natural matrices, but in defined, nonconditioned medium only Matrigel or (natural and recombinant) vitronectin was effective. Recombinant vitronectin was the only defined functional alternative to Matrigel, supporting sustained self-renewal and pluripotency in three independent hESC lines.

Regeneration of the myocardium by transplantation of cardiomyocytes is an emerging therapeutic strategy. Human embryonic stem cells (HESC) form cardiomyocytes readily but until recently at low efficiency, so that preclinical studies on transplantation in animals are only just beginning. Here, we show the results of the first long-term (12 weeks) analysis of the fate of HESC-derived cardiomyocytes transplanted intramyocardially into healthy, immunocompromised (NOD-SCID) mice and in NOD-SCID mice that had undergone myocardial infarction (MI). Transplantation of mixed populations of differentiated HESC containing 20–25% cardiomyocytes in control mice resulted in rapid formation of grafts in which the cardiomyocytes became organized and matured over time and the noncardiomyocyte population was lost. Grafts also formed in mice that had undergone MI. Four weeks after transplantation and MI, this resulted in significant improvement in cardiac function measured by magnetic resonance imaging. However, at 12 weeks, this was not sustained despite graft survival. This suggested that graft size was still limiting despite maturation and organization of the transplanted cells. More generally, the results argued for requiring a minimum of 3 months follow-up in studies claiming to observe improved cardiac function, independent of whether HESC or other (adult) cell types are used for transplantation.