Large-scale genomic characterization of tumors from prospective cohort studies may yield new insights into cancer pathogenesis. We performed whole-exome sequencing of 619 incident colorectal cancers (CRCs) and integrated the results with tumor immunity, pathology, and survival data. We identified recurrently mutated genes in CRC, such as BCL9L, RBM10, CTCF, and KLF5, that were not previously appreciated in this disease. Furthermore, we investigated the genomic correlates of immune-cell infiltration and found that higher neoantigen load was positively associated with overall lymphocytic infiltration, tumor-infiltrating lymphocytes (TILs), memory T cells, and CRC-specific survival. The association with TILs was evident even within microsatellite-stable tumors. We also found positive selection of mutations in HLA genes and other components of the antigen-processing machinery in TIL-rich tumors. These results may inform immunotherapeutic approaches in CRC. More generally, this study demonstrates a framework for future integrative molecular epidemiology research in colorectal and other malignancies.

Objective

 Accumulating evidence links the intestinal microbiota and colorectal carcinogenesis. Fusobacterium nucleatum may promote colorectal tumour growth and inhibit T cell-mediated immune responses against colorectal tumours. Thus, we hypothesised that the amount of F. nucleatum in colorectal carcinoma might be associated with worse clinical outcome. 

Design

 We used molecular pathological epidemiology database of 1069 rectal and colon cancer cases in the Nurses’ Health Study and the Health Professionals Follow-up Study, and measured F. nucleatum DNA in carcinoma tissue. Cox proportional hazards model was used to compute hazard ratio (HR), controlling for potential confounders, including microsatellite instability (MSI, mismatch repair deficiency), CpG island methylator phenotype (CIMP), KRAS, BRAF, and PIK3CA mutations, and LINE-1 hypomethylation (low-level methylation). 

Results

 Compared with F. nucleatum-negative cases, multivariable HRs (95% CI) for colorectal cancer-specific mortality in F. nucleatum-low cases and F. nucleatum-high cases were 1.25 (0.82 to 1.92) and 1.58 (1.04 to 2.39), respectively, (p for trend=0.020). The amount of F. nucleatum was associated with MSI-high (multivariable odd ratio (OR), 5.22; 95% CI 2.86 to 9.55) independent of CIMP and BRAF mutation status, whereas CIMP and BRAF mutation were associated with F. nucleatum only in univariate analyses (p<0.001) but not in multivariate analysis that adjusted for MSI status. 

Conclusions

 The amount of F. nucleatum DNA in colorectal cancer tissue is associated with shorter survival, and may potentially serve as a prognostic biomarker. Our data may have implications in developing cancer prevention and treatment strategies through targeting GI microflora by diet, probiotics and antibiotics.

Importance

 Evidence indicates a complex link between gut microbiome, immunity, and intestinal tumorigenesis. To target the microbiota and immunity for colorectal cancer prevention and therapy, a better understanding of the relationship between microorganisms and immune cells in the tumor microenvironment is needed. Experimental evidence suggests thatFusobacterium nucleatummay promote colonic neoplasia development by downregulating antitumor T cell–mediated adaptive immunity. 

Objective

 To test the hypothesis that a greater amount ofF nucleatumin colorectal carcinoma tissue is associated with a lower density of T cells in tumor tissue. 

Design, Setting, and Participants

 A cross-sectional analysis was conducted on 598 rectal and colon carcinoma cases in 2 US nationwide prospective cohort studies with follow-up through 2006, the Nurses’ Health Study (participants enrolled in 1976) and the Health Professionals Follow-up Study (participants enrolled in 1986). Tissue collection and processing were performed from 2002 through 2008, and immunity assessment, 2008 through 2009. From 2013 through 2014, the amount ofF nucleatumin colorectal carcinoma tissue was measured by quantitative polymerase chain reaction assay; we equally dichotomized positive cases (high vs low). Multivariable ordinal logistic regression analysis was conducted in 2014 to assess associations of the amount ofF nucleatumwith densities (quartiles) of T cells in tumor tissue, controlling for clinical and tumor molecular features, including microsatellite instability, CpG island methylator phenotype, long interspersed nucleotide element-1 (LINE-1) methylation, andKRAS,BRAF, andPIK3CAmutation status. We adjusted the 2-sided α level to .013 for multiple hypothesis testing. 

Main Outcomes and Measures

 Densities of CD3⁺, CD8⁺, CD45RO (protein tyrosine phosphatase receptor type C [PTPRC])⁺, and FOXP3⁺T cells in tumor tissue, determined by means of tissue microarray immunohistochemical analysis and computer-assisted image analysis. 

Results

 F nucleatumwas detected in colorectal carcinoma tissue in 76 (13%) of 598 cases. Compared withF nucleatum–negative cases,F nucleatum–high cases were inversely associated with the density of CD3⁺T cells (for a unit increase in quartile categories of CD3⁺T cells as an outcome: multivariable odds ratio, 0.47 [95% CI, 0.26-0.87];Pfor trend = .006). The amount ofF nucleatumwas not significantly associated with the density of CD8⁺, CD45RO⁺, or FOXP3⁺T cells (P fortrend = .24, .88, and .014, respectively). 

Conclusions and Relevance

 The amount of tissueF nucleatumis inversely associated with CD3⁺T-cell density in colorectal carcinoma tissue. On validation, our human population data may provide an impetus for further investigations on potential interactive roles ofFusobacteriumand host immunity in colon carcinogenesis.

// Kei Mitsuhashi 1 , Katsuhiko Nosho 1 , Yasutaka Sukawa 2 , Yasutaka Matsunaga 1 , Miki Ito 1 , Hiroyoshi Kurihara 1 , Shinichi Kanno 1 , Hisayoshi Igarashi 1 , Takafumi Naito 1 , Yasushi Adachi 1 , Mami Tachibana 1 , Tokuma Tanuma 1, 3 , Hiroyuki Maguchi 3 , Toshiya Shinohara 4 , Tadashi Hasegawa 5 , Masafumi Imamura 6 , Yasutoshi Kimura 6 , Koichi Hirata 6 , Reo Maruyama 7 , Hiromu Suzuki 7 , Kohzoh Imai 8 , Hiroyuki Yamamoto 9, * , Yasuhisa Shinomura 9, * 1 Department of Gastroenterology, Rheumatology and Clinical Immunology, Sapporo Medical University School of Medicine, Sapporo, Japan 2 Department of Medical Oncology, Dana-Farber Cancer Institute and Harvard Medical School, Boston, MA, USA 3 Department of Gastroenterology, Teine Keijinkai Hospital, Sapporo, Japan 4 Department of Pathology, Teine Keijinkai Hospital, Sapporo, Japan 5 Department of Surgical Pathology, Sapporo Medical University School of Medicine, Sapporo, Japan 6 Department of Surgery, Surgical Oncology and Science, Sapporo Medical University School of Medicine, Sapporo, Japan 7 Department of Molecular Biology, Sapporo Medical University School of Medicine, Sapporo, Japan 8 The Institute of Medical Science, The University of Tokyo, Tokyo, Japan 9 Department of Gastroenterology and Hepatology, St. Marianna University School of Medicine, Kawasaki, Japan * These authors have contributed equally to this work Correspondence to: Katsuhiko Nosho, e-mail: nosho@sapmed.ac.jp Keywords: Fusobacterium, microbiota, pancreas, miR-31, survival Received: December 04, 2014      Accepted: January 08, 2015      Published: March 13, 2015 ABSTRACT Recently, bacterial infection causing periodontal disease has attracted considerable attention as a risk factor for pancreatic cancer. Fusobacterium species is an oral bacterial group of the human microbiome. Some evidence suggests that Fusobacterium species promote colorectal cancer development; however, no previous studies have reported the association between Fusobacterium species and pancreatic cancer. Therefore, we examined whether Fusobacterium species exist in pancreatic cancer tissue. Using a database of 283 patients with pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), we tested cancer tissue specimens for Fusobacterium species. We also tested the specimens for KRAS , NRAS , BRAF and PIK3CA mutations and measured microRNA-21 and microRNA-31. In addition, we assessed epigenetic alterations, including CpG island methylator phenotype (CIMP). Our data showed an 8.8% detection rate of Fusobacterium species in pancreatic cancers; however, tumor Fusobacterium status was not associated with any clinical and molecular features. In contrast, in multivariate Cox regression analysis, compared with the Fusobacterium species-negative group, we observed significantly higher cancer-specific mortality rates in the positive group ( p = 0.023). In conclusion, Fusobacterium species were detected in pancreatic cancer tissue. Tumor Fusobacterium species status is independently associated with a worse prognosis of pancreatic cancer, suggesting that Fusobacterium species may be a prognostic biomarker of pancreatic cancer.

Human gut microbiota is being increasingly recognized as a player in colorectal cancers (CRCs). Evidence suggests that Fusobacterium nucleatum (F. nucleatum) may contribute to disease progression and is associated with CpG island methylator phenotype (CIMP) and microsatellite instability (MSI) in CRCs; however, to date, there are no reports about the relationship between F. nucleatum and molecular features in the early stage of colorectal tumorigenesis. Therefore, we investigated the presence of F. nucleatum in premalignant colorectal lesions. In total, 465 premalignant lesions (343 serrated lesions and 122 non-serrated adenomas) and 511 CRCs were studied. We determined the presence of F. nucleatum and analyzed its association with molecular features including CIMP, MSI and microRNA-31 status. F. nucleatum was detected in 24% of hyperplastic polyps, 35% of sessile serrated adenomas (SSAs), 30% of traditional serrated adenomas (TSAs) and 33% of non-serrated adenomas. F. nucleatum was more frequently detected in CIMP-high premalignant lesions than in CIMP-low/zero lesions (p = 0.0023). In SSAs, F. nucleatum positivity increased gradually from sigmoid colon to cecum (p = 0.042). F. nucleatum positivity was significantly higher in CRCs (56%) than in premalignant lesions of any histological type (p < 0.0001). In conclusion, F. nucleatum was identified in premalignant colorectal lesions regardless of histopathology but was more frequently associated with CIMP-high lesions. Moreover, F. nucleatum positivity increased according to histological grade, suggesting that it may contribute to the progression of colorectal neoplasia. Our data also indicate that F. nucleatum positivity in SSAs may support the "colorectal continuum" concept.