NF-κB is critical for determining cellular sensitivity to apoptotic stimuli by regulating both mitochondrial and death receptor apoptotic pathways. The endoplasmic reticulum (ER) emerges as a new apoptotic signaling initiator. However, the mechanism by which ER stress activates NF-κB and its role in regulation of ER stress-induced cell death are largely unclear. Here, we report that, in response to ER stress, IKK forms a complex with IRE1α through the adapter protein TRAF2. ER stress-induced NF-κB activation is impaired in IRE1α knockdown cells and IRE1α−/− MEFs. We found, however, that inhibiting NF-κB significantly decreased ER stress-induced cell death in a caspase-8-dependent manner. Gene expression analysis revealed that ER stress-induced expression of tumor necrosis factor alpha (TNF-α) was IRE1α and NF-κB dependent. Blocking TNF receptor 1 signaling significantly inhibited ER stress-induced cell death. Further studies suggest that ER stress induces down-regulation of TRAF2 expression, which impairs TNF-α-induced activation of NF-κB and c-Jun N-terminal kinase and turns TNF-α from a weak to a powerful apoptosis inducer. Thus, ER stress induces two signals, namely TNF-α induction and TRAF2 down-regulation. They work in concert to amplify ER-initiated apoptotic signaling through the membrane death receptor.

Abstract Gluconeogenesis from lactate, pyruvate, fructose, glycerol, amino acids, and other compounds was examined in the isolated rat liver perfused with buffer containing blood cells and serum albumin. The following observations were made. The condition of the liver remained good during 2 hours of perfusion at 37° as judged by its gross appearance, oxygen uptake, bile production, water content, and linear rates of glucose production from various substrates. The highest rate of glucose production (about 120 µmoles per g of liver per hour) was observed with saturating concentrations of fructose or dihydroxyacetone. This rate was double that with a saturating level of l-lactate or pyruvate, suggesting that the steps limiting gluconeogenesis from lactate or pyruvate lie before the formation of triose phosphate. The concentration of lactate for half-maximum gluconeogenesis was about 2 mm and that of pyruvate, about 1 mm. The same maximum rate of gluconeogenesis was observed with both substrates. Glycerol, d-glyceraldehyde, l-alanine, or l-serine at high concentrations supported rates of gluconeogenesis about double that found without added substrate (or approximately one-half the maximum rate with l-lactate). d-Lactate, other amino acids, and Krebs cycle intermediates were poor precursors when added singly. With a mixture of amino acids at plasma concentrations, basal glucose production was increased 3-fold and with 1 mm lactate it was doubled. The mean time for conversion of lactate to glucose was 75 sec. The rate of glucose utilization by the liver was low compared with gluconeogenesis. High levels of glucose did not suppress gluconeogenesis from saturating concentrations of lactate. Glucose was the major product of lactate, pyruvate, and fructose metabolism. Lactate production with fructose was greater than that with glucose. With pyruvate-2-14C, there was a 3-fold greater incorporation of isotope into glucose plus glycogen than into CO2. With pyruvate-1-14C, labeling of hexose was much less than that of CO2 and was 38% of that found with pyruvate-2-14C. A mathematical treatment of the isotopic data was developed. With certain assumptions, it was computed that pyruvate was converted to oxalacetate at twice the rate at which it was converted to acetyl coenzyme A, and that most of the acetyl-CoA formed from pyruvate entered the Krebs cycle. It was also deduced that the rate of conversion of oxalacetate to phosphopyruvate was 3-fold greater than the rate of conversion to citrate. There was no correlation between the rates of gluconeogenesis and ketogenesis. Lactate increased glucose production 4-fold but decreased ketogenesis by 70%. Physiological levels of oleate stimulated ketogenesis but not gluconeogenesis in livers from fasted or fed rats. In fed rats, octanoate increased ketogenesis 3-fold but did not affect gluconeogenesis.

Isolated rat hepatocytes responded to a variety of Ca2+-mobilizing agents (vasopressin, angiotensin II, epinephrine, epidermal growth factor, ATP, and ADP) with a rapid increase in phosphatidate mass, as measured by a sensitive new method. When hepatocytes were incubated with vasopressin (10(-8) M), phosphatidate levels increased 2-3-fold in 2 min, but there was no significant increase in diacylglycerol at this time. Changes in the fatty acid composition of phosphatidate also preceded those in diacylglycerol. De novo synthesis of phosphatidate from [3H]glycerol was unaffected by vasopressin in short-term incubation. Incubation of washed rat liver plasma membranes with GTP gamma S caused a time-dependent increase in phosphatidate. When membranes were incubated with GTP gamma S and [gamma-32P]ATP, no incorporation of 32P into phosphatidate was observed. This excludes the phospholipase C-diacylglycerol kinase pathway and suggests that a phospholipase D activity produced the phosphatidate. At submaximal concentrations of GTP gamma S, ATP and ADP stimulated membrane phosphatidate formation, presumably by acting through P2-purinergic receptors. Only phosphatidylcholine, among the major phospholipids, decreased in the membranes in response to GTP gamma S. The fatty acid composition of the phosphatidate produced in response to vasopressin in hepatocytes also suggests that phosphatidylcholine may be the source of hormonally elicited phosphatidate. We conclude that Ca2+-mobilizing hormones mainly increase phosphatidate levels in hepatocytes by a mechanism that does not involve phosphorylation of diacylglycerol or de novo synthesis but involves a guanine nucleotide-binding protein coupled to phospholipase D.

Gluconeogenesis from amino acids was investigated with isolated rat livers perfused with Krebs bicarbonate buffer containing bovine red cells and serum albumin. In livers from fasted rats perfused with a mixture of amino acids at various multiples of their normal plasma concentrations, glucose production was half-maximal at normal amino acid concentrations and approached saturation at three times normal concentrations. Urea production also rose with increasing concentrations of amino acids, but was not saturated at four times normal levels. It is concluded that the rate of release of amino acids from peripheral tissues can be important in controlling hepatic gluconeogenesis. In livers perfused with physiological levels of amino acids, glucagon increased alanine conversion to glucose 3.5-fold and produced changes in the steady state concentrations of intermediates of the gluconeogenic pathway which indicated stimulation of the conversion of pyruvate to phosphopyruvate. With high concentrations of alanine, transamination became a significant rate-limiting step for gluconeogenesis. Under these conditions glucagon or cyclic 3',5'-AMP increased alanine conversion to glucose 2- to 3-fold, and the changes in intermediates indicated that they also stimulated the transport of alanine into the cell. Maximum gluconeogenesis from alanine was reached only when the perfusate concentration of alanine was 20 times the normal, physiological level. Glucagon stimulated both glucose and urea production from the amino acid mixture at all amino acid concentrations studied. Urea production was also stimulated by epinephrine and cyclic 3',5'-AMP in livers perfused with or without amino acids. It is proposed that glucagon and possibly catecholamines play a role in the physiological regulation of gluconeogenesis from amino acids by increasing the formation of cyclic 3',5'AMP, which acts to stimulate both the transport of amino acids into the hepatic cell and the conversion of pyruvate to P-pyruvate.

Purified M1 muscarinic cholinergic receptor and Gq/11 were coreconstituted in lipid vesicles. Addition of purified phospholipase C-beta 1 (PLC-beta 1) further stimulated the receptor-promoted steady-state GTPase activity of Gq/11 up to 20-fold. Stimulation depended upon receptor-mediated GTP-GDP exchange. Addition of PLC-beta 1 caused a rapid burst of hydrolysis of Gq/11-bound GTP that was at least 50-fold faster than in its absence. Thus, PLC-beta 1 stimulates hydrolysis of Gq/11-bound GTP and acts as a GTPase-activating protein (GAP) for its physiologic regulator, Gq/11. GTPase-stimulating activity was specific both for PLC-beta 1 and Gq/11. Such GAP activity by an effector coupled to a trimeric G protein can reconcile slow GTP hydrolysis by pure G proteins in vitro with fast physiologic deactivation of G protein-mediated signaling.

A method utilizing precipitation on filter paper has been used to isolate glycogen from homogenates of liver or isolated hepatocytes. The procedure requires very small amounts of tissue or cell suspension and is rapid and highly reproducible. Its efficiency and specificity make it very suitable for many studies involving radioactive tracer incorporation into glycogen.

Calcium-sensitive inositide release in a purified rat liver plasma membrane preparation is increased by calcium-mobilizing hormones in the presence of guanine nucleotides. Vasopressin-stimulated inositide release is evident in the presence of GTP or its nonhydrolyzable analogs guanyl-5'-yl imidodiphosphate and guanosine 5'-(3-O-thio)triphosphate (GTP gamma S). The stimulation of inositide release by (-)-epinephrine (alpha 1), angiotensin II, or vasopressin in the presence of either 1 microM or 10 microM GTP gamma S correlates with the number of receptors present for each hormone. The guanine nucleotide and hormonal stimulation is evident on both inositol trisphosphate production and phosphatidylinositol bisphosphate degradation. Ethylene glycol bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N',N‘-tetraacetic acid (1 mM) completely abolishes stimulation by guanine nucleotides and hormone. Prior treatment of plasma membranes with cholera toxin or islet activating protein or prior injection of animals with islet activating protein does not affect stimulation of inositide release by GTP gamma S or GTP gamma S plus vasopressin. Stimulation by GTP gamma S is dependent upon magnesium and is inhibitable by guanosine 5‘-(2-O-thio) diphosphate. Inositide release from the plasma membrane exhibits half-maximal stimulation by calcium at approximately 100 nM free calcium in the presence of 1.5 mM MgCl2 and at approximately 10 microM free calcium in the presence of 10 mM MgCl2. Addition of guanine nucleotides decreases the requirement for calcium and also increases the activity at saturating calcium. The results presented suggest that calcium-mobilizing hormones stimulate polyphosphoinositide breakdown in rat liver plasma membranes through a novel guanine nucleotide binding protein.

The Ca2+ selective fluorescent indicator, Quin-2, was employed to monitor continuously the concentration of free cytosolic Ca2+ [ Ca2+ ]i in isolated rat hepatocytes. Epinephrine (10(-6) M) and phenylephrine (10(-5) M), acting via alpha 1-adrenergic receptors, increases [ Ca2+ ]i from a basal concentration of approximately 0.2 microM to approximately 0.6 microM. This increase in [ Ca2+ ]i is evident as early as 1 to 1.5 s, the earliest time so far reported for any hepatic alpha 1-adrenergic event. Vasopressin (10(-8) M), after a lag which is 2 to 3 s longer, increases [ Ca2+ ]i to the same extent and at the same rate as the alpha 1-adrenergic agonists. Glucagon (10(-8) M) also increases [ Ca2+ ]i but at a significantly slower rate and only after a lag of about 10 s. All of these agents also induce an increase in the fluorescence of control cells. This Quin-2 independent fluorescence, which is due to an increased reduction of pyridine nucleotides, must be corrected for before the maximum change in [ Ca2+ ]i can be calculated but is sufficiently slow so as not to contribute to the initial rate of increase in the Quin-2-dependent fluorescence.

Abstract Injection of guinea pig anti-insulin serum into rats decreased the concentration of glycogen in the liver and increased the level of nonesterified fatty acid and glucose in the blood and the concentration of citrate in the heart. The uptake of glucose was reduced in hearts removed from antiserum-treated rats and perfused in vitro. Glucose production by perfused livers from rats treated with antiserum in vivo was increased as a result of accelerated glycogenolysis and gluconeogenesis. Urea production and K+ efflux were also increased. The rates of these processes could be reduced to or below control values by addition of insulin to the perfusion medium. Insulin added in vitro also decreased these processes and the loss of inorganic phosphate in livers from normal rats. Antiserum added to the medium perfusing normal hearts or livers was without effect except that it abolished the action of insulin. Administration of anti-insulin serum in vivo caused a progressive rise in the liver cyclic AMP concentration. Diabetes induced by alloxan also resulted in an increase in liver cyclic AMP, which was rapidly abolished by insulin treatment. Insulin added to the medium perfusing livers from normal or antiserum-treated rats caused a small decrease in liver cyclic AMP. Insulin antagonized the effects of epinephrine and glucagon on glucose output by the perfused liver and reduced the level of cyclic AMP in the presence of glucagon. The hypothesis is advanced that changes in cyclic AMP levels may be partly responsible for the alterations in liver metabolism caused by insulin and diabetes.