Summary

 Reprogramming somatic cells into pluripotent embryonic stem cells (ESCs) by somatic cell nuclear transfer (SCNT) has been envisioned as an approach for generating patient-matched nuclear transfer (NT)-ESCs for studies of disease mechanisms and for developing specific therapies. Past attempts to produce human NT-ESCs have failed secondary to early embryonic arrest of SCNT embryos. Here, we identified premature exit from meiosis in human oocytes and suboptimal activation as key factors that are responsible for these outcomes. Optimized SCNT approaches designed to circumvent these limitations allowed derivation of human NT-ESCs. When applied to premium quality human oocytes, NT-ESC lines were derived from as few as two oocytes. NT-ESCs displayed normal diploid karyotypes and inherited their nuclear genome exclusively from parental somatic cells. Gene expression and differentiation profiles in human NT-ESCs were similar to embryo-derived ESCs, suggesting efficient reprogramming of somatic cells to a pluripotent state. 

PaperClip

Mitochondria are found in all eukaryotic cells and contain their own genome (mitochondrial DNA or mtDNA). Unlike the nuclear genome, which is derived from both the egg and sperm at fertilization, the mtDNA in the embryo is derived almost exclusively from the egg; that is, it is of maternal origin. Mutations in mtDNA contribute to a diverse range of currently incurable human diseases and disorders. To establish preclinical models for new therapeutic approaches, we demonstrate here that the mitochondrial genome can be efficiently replaced in mature non-human primate oocytes (Macaca mulatta) by spindle–chromosomal complex transfer from one egg to an enucleated, mitochondrial-replete egg. The reconstructed oocytes with the mitochondrial replacement were capable of supporting normal fertilization, embryo development and produced healthy offspring. Genetic analysis confirmed that nuclear DNA in the three infants born so far originated from the spindle donors whereas mtDNA came from the cytoplast donors. No contribution of spindle donor mtDNA was detected in offspring. Spindle replacement is shown here as an efficient protocol replacing the full complement of mitochondria in newly generated embryonic stem cell lines. This approach may offer a reproductive option to prevent mtDNA disease transmission in affected families. Mitochondrial DNA (mtDNA) is passed from mother to offspring, with sperm mitochondria contributing no DNA to the embryo. Mutations in mtDNA are linked to a range of diseases including type 2 diabetes, mitochondrial myopathies and neuropathies. This paper demonstrates in a non-human primate model that a defective mitochondrial genome can be replaced by transferring the spindle–chromosome complex from one egg into an egg from which the nucleus is removed. The experiment utilized unfertilized eggs from two female rhesus macaque monkeys as 'nuclear' and 'cytoplasmic' donors. The resulting eggs were fertilized and developed into embryos that were implanted in surrogates resulting in the birth of healthy twins, named Mito and Tracker in a reference to the probes used for imaging mitochondria. This suggests a route to an assisted reproductive technology approach to preventing mtDNA disease transmission in affected families. See also the Nature Editorial on the ethical aspects of this work in the 27 August issue (Vol. 460, p. 1057 ). The mitochondrial genome is of maternal origin and mutations in mitochondrial DNA are the cause of many human diseases. The efficient replacement of the mitochondrial genome in mature non-human primate oocytes is now demonstrated. This approach may offer a reproductive option to prevent the transmission of diseases caused by mutations in mitochondrial DNA in affected families.

Mutations in mitochondrial DNA (mtDNA) are associated with severe human diseases and are maternally inherited through the egg’s cytoplasm. Here we investigated the feasibility of mtDNA replacement in human oocytes by spindle transfer (ST; also called spindle–chromosomal complex transfer). Of 106 human oocytes donated for research, 65 were subjected to reciprocal ST and 33 served as controls. Fertilization rate in ST oocytes (73%) was similar to controls (75%); however, a significant portion of ST zygotes (52%) showed abnormal fertilization as determined by an irregular number of pronuclei. Among normally fertilized ST zygotes, blastocyst development (62%) and embryonic stem cell isolation (38%) rates were comparable to controls. All embryonic stem cell lines derived from ST zygotes had normal euploid karyotypes and contained exclusively donor mtDNA. The mtDNA can be efficiently replaced in human oocytes. Although some ST oocytes displayed abnormal fertilization, remaining embryos were capable of developing to blastocysts and producing embryonic stem cells similar to controls. Mutations in mitochondrial DNA cause a wide range of disorders in humans, with a high prevalence; here it is shown that the nucleus of an affected woman’s egg could be inserted into healthy donor egg cytoplasm by spindle transfer, allowing the birth of healthy offspring. Mutations in mitochondrial DNA (mtDNA) cause various human diseases. Their inheritance is through the mother because all zygotic mitochondria derive from the oocyte. Shoukhrat Mitalipov and colleagues previously reported proof-of-concept replacement of mtDNA through chromosome spindle transfer in macaque oocytes, and here they extend the technology to human oocytes. They also report on the health of a 3-year-old macaque born from an mtDNA-replaced oocyte. This work suggests that replacement therapy for mtDNA disorders could become a reality. Dieter Egli and colleagues took a different approach: they performed nuclear genome transfer between unfertilized human oocytes from two different donors. The resulting oocytes retained the ability to develop to the blastocyst stage and to produce embryonic stem cell lines with normal karyotypes. This technique has the potential to prevent the transmission of mtDNA mutations without causing manipulation-induced karyotypic abnormalities.

Human pluripotent stem cells hold potential for regenerative medicine, but available cell types have significant limitations. Although embryonic stem cells (ES cells) from in vitro fertilized embryos (IVF ES cells) represent the ‘gold standard’, they are allogeneic to patients. Autologous induced pluripotent stem cells (iPS cells) are prone to epigenetic and transcriptional aberrations. To determine whether such abnormalities are intrinsic to somatic cell reprogramming or secondary to the reprogramming method, genetically matched sets of human IVF ES cells, iPS cells and nuclear transfer ES cells (NT ES cells) derived by somatic cell nuclear transfer (SCNT) were subjected to genome-wide analyses. Both NT ES cells and iPS cells derived from the same somatic cells contained comparable numbers of de novo copy number variations. In contrast, DNA methylation and transcriptome profiles of NT ES cells corresponded closely to those of IVF ES cells, whereas iPS cells differed and retained residual DNA methylation patterns typical of parental somatic cells. Thus, human somatic cells can be faithfully reprogrammed to pluripotency by SCNT and are therefore ideal for cell replacement therapies. Genome-wide analysis of matched human IVF embryonic stem cells (IVF ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells) and nuclear transfer ES cells (NT ES cells) derived by somatic cell nuclear transfer (SCNT) reveals that human somatic cells can be faithfully reprogrammed to pluripotency by SCNT; NT ES cells and iPS cells derived from the same somatic cells contain comparable numbers of de novo copy number variations, but whereas DNA methylation and transcriptome profiles of NT ES cells and IVF ES cells are similar, iPS cells have residual patterns typical of parental somatic cells. This study compares the distinct genetic, epigenetic and transcriptional signatures of human pluripotent stem cells produced by somatic cell nuclear transfer (SCNT) with induced pluripotent stem (iPS) cells produced by transcription-factor-mediated reprogramming. Both cell types were produced from the same pool of somatic donor cells to ensure a genetic match. iPS cells and SCNT-derived embryonic stem cells contained comparable de novo copy number variations. The abnormalities previously reported — residual DNA methylation patterns typical of parental somatic cells — were observed as anticipated in the iPS cells, but not in the SCNT-derived cells. This suggests that human somatic cells can be faithfully reprogrammed to pluripotency by SCNT and therefore might be more appropriate than iPS cells for use in cell replacement therapies.