Spatially addressable DNA nanostructures facilitate the self-assembly of heterogeneous elements with precisely controlled patterns. Here we organized discrete glucose oxidase (GOx)/horseradish peroxidase (HRP) enzyme pairs on specific DNA origami tiles with controlled interenzyme spacing and position. The distance between enzymes was systematically varied from 10 to 65 nm, and the corresponding activities were evaluated. The study revealed two different distance-dependent kinetic processes associated with the assembled enzyme pairs. Strongly enhanced activity was observed for those assemblies in which the enzymes were closely spaced, while the activity dropped dramatically for enzymes as little as 20 nm apart. Increasing the spacing further resulted in a much weaker distance dependence. Combined with diffusion modeling, the results suggest that Brownian diffusion of intermediates in solution governed the variations in activity for more distant enzyme pairs, while dimensionally limited diffusion of intermediates across connected protein surfaces contributed to the enhancement in activity for closely spaced GOx/HRP assemblies. To further test the role of limited dimensional diffusion along protein surfaces, a noncatalytic protein bridge was inserted between GOx and HRP to connect their hydration shells. This resulted in substantially enhanced activity of the enzyme pair.

A DNA nanostructure can be used to create a multi-enzyme complex in which an artificial swinging arm facilitates hydride transfer between two coupled dehydrogenases. Swinging arms are a key functional component of multistep catalytic transformations in many naturally occurring multi-enzyme complexes1. This arm is typically a prosthetic chemical group that is covalently attached to the enzyme complex via a flexible linker, allowing the direct transfer of substrate molecules between multiple active sites within the complex2,3,4. Mimicking this method of substrate channelling outside the cellular environment requires precise control over the spatial parameters of the individual components within the assembled complex. DNA nanostructures can be used to organize functional molecules with nanoscale precision5,6,7 and can also provide nanomechanical control8,9,10,11. Until now, protein–DNA assemblies12 have been used to organize cascades of enzymatic reactions by controlling the relative distance and orientation of enzymatic components13,14,15,16 or by facilitating the interface between enzymes/cofactors and electrode surfaces17,18. Here, we show that a DNA nanostructure can be used to create a multi-enzyme complex in which an artificial swinging arm facilitates hydride transfer between two coupled dehydrogenases. By exploiting the programmability of DNA nanostructures, key parameters including position, stoichiometry and inter-enzyme distance can be manipulated for optimal activity.

Abstract Cells routinely compartmentalize enzymes for enhanced efficiency of their metabolic pathways. Here we report a general approach to construct DNA nanocaged enzymes for enhancing catalytic activity and stability. Nanocaged enzymes are realized by self-assembly into DNA nanocages with well-controlled stoichiometry and architecture that enabled a systematic study of the impact of both encapsulation and proximal polyanionic surfaces on a set of common metabolic enzymes. Activity assays at both bulk and single-molecule levels demonstrate increased substrate turnover numbers for DNA nanocage-encapsulated enzymes. Unexpectedly, we observe a significant inverse correlation between the size of a protein and its activity enhancement. This effect is consistent with a model wherein distal polyanionic surfaces of the nanocage enhance the stability of active enzyme conformations through the action of a strongly bound hydration layer. We further show that DNA nanocages protect encapsulated enzymes against proteases, demonstrating their practical utility in functional biomaterials and biotechnology.

Abstract Nucleic acid detection plays a crucial role in various applications, including disease diagnostics, research development, food safety, and environmental health monitoring. A rapid, point‐of‐care (POC) nucleic acid test can greatly benefit healthcare system by providing timely diagnosis for effective treatment and patient management, as well as supporting diseases surveillance for emerging pandemic diseases. Recent advancements in nucleic acids technology have led to rapid assays for single‐stranded nucleic acids that can be integrated into simple and miniaturized platforms for ease of use. In this review, the study focuses on the developments in isothermal amplification, nucleic acid hybridization circuits, various enzyme‐based signal reporting mechanisms, and detection platforms that show promise for POC testing. The study also evaluates critical technical breakthroughs to identify the advantages and disadvantages of these methods in various applications.