Pulmonary arterial hypertension (PAH) is characterized by vascular obstruction leading to progressive elevation of pulmonary artery pressure. In the face of pressure overload, the right ventricle (RV) initially compensates (adaptive hypertrophy), but ultimately transitions to a decompensated state (marked by cardiomyocyte apoptosis and fibrosis), leading to premature death. The histone acetyltransferases P300/CBP have been identified as key pathogenic factors promoting the activation of a fetal gene program, supporting vascular remodeling in the lungs of PAH patients. Previous studies have also implicated P300/CBP in the control of pathological cardiac hypertrophy and fibrosis. However, their role in RV failure associated with PAH has never been explored. We hypothesized that P300/CBP contribute to maladaptive RV remodeling in PAH and thus represent a potential therapeutic target. We show by Western blot (WB) and immunofluorescence (IF) that P300 expression is upregulated in compensated and decompensated RV from PAH patients, monocrotaline (MCT)- and pulmonary artery banding (PAB)-exposed rats (p<0.05), whereas CBP expression remains unchanged. RV fibroblasts (RVfbs) isolated from compensated or decompensated RV display a pro-fibrotic phenotype (increased COL, Fn, MMP and aSMA expression, WB p<0.05) associated with an increase in P300/CBP expression (WB, p<0.01). In vitro, pharmacological (CCS-1477) or molecular (combined siRNA) inhibition of P300/CBP decreases proliferation/survival (WB PCNA, Survivin, p<0.05) and activation (WB pSMAD2/3, aSMA, Fn, Col1, MMP2, p<0.05) of RVfibs. These effects were associated with a reduction in H3K27 acetylation (WB, p<0.05). In addition, P300/CBP inhibition prevents phenylephrine-induced hypertrophy in H9C2 cells and in isolated adult rat cardiomyocytes (IF, p<0.05). Using human precision-cut RV slices stimulated with phenylephrine and TGFb, we show that P300/CBP inhibition attenuates fibrosis [Masson’s trichrome staining (MT), p<0.05] and cardiomyocyte (CM) hypertrophy [hematoxylin and eosin staining (HE), p<0.05]. In vivo, administration of CCS-1477 in a PAB rat model reduces fibrosis (MT, p<0.05), CM surface area (HE, p<0.01), and improves RV function (TAPSE, cardiac output, stroke volume, p<0.05). Our finding provide evidence that targeting P300/CBP may represent a promising avenue to counter maladaptive RV remodeling in PAH.

Introduction: Pulmonary arterial hypertension (PAH) is characterized by vasoconstriction and vascular remodeling of the distal pulmonary arteries (PAs) leading to progressive elevation of PA pressure, right heart failure and death. Extensive proliferation and resistance to apoptosis of PA smooth muscle cells (PASMCs) is perhaps the most prominent feature of PAH accounting for the histopathological changes seen in this disease. With the recognition of this, direct targeting of vascular remodeling may represent a promising strategy. Goal: To illuminate new actionable targets involved in pulmonary vascular remodeling in PAH. Methods: Molecular, biochemical and pharmacological approaches were used to identify Never In Mitosis A-Related Kinase 2 (NEK2) and study its role in pulmonary vascular remodeling in PAH Results: We performed a comparative RNA-sequencing analysis between control and PAH-PASMCs and then integrated our dataset with publicly available datasets conducted on comparable samples. Among the genes that were concordantly up-regulated in PAH-PASMCs, we identified NEK2, a kinase and druggable target implicated in the progression of mitosis. Using Western blot (WB) and immunofluorescence (IF), we confirmed that NEK2 is upregulated in PASMCs and distal PAs of PAH patients and animal models (Sugen/Hypoxia- and monocrotaline-exposed rats). Pharmacological (NCL0017509) and molecular (siNEK2) inhibition of NEK2 reduced PAH-PASMCs proliferation, as assessed by IF (Ki67 labeling, EdU incorporation, p<0.05) and qPCR (MCM2, PLK1 and Survivin , p<0.05). Further analysis revealed that pharmacological inhibition of NEK2 blocks cell cycle progression in the G2/M phase (flow cytometry, p<0.01) and increases DNA damage (comet assay p<0.001, WB of pDNAPK/DNAPK and RAD51, p<0.05). Moreover, we found that PAH-PASMCs subjected to NEK2 inhibition acquire a senescent phenotype (WB of p16, p21 and p53, p<0.05). Conclusion: Our results suggest that NEK2 contributes to the pro-proliferative phenotype of PAH-PASMC and may represent a new target in PAH.

Introduction: Pulmonary arterial hypertension (PAH) is characterized by progressive obstruction and decreased compliance of pulmonary arteries (PA), leading to right ventricular failure and premature death. Sustained proliferation and resistance to apoptosis of PAs smooth muscle and endothelial cells (PASMCs, PAECs) and accumulation of extracellular matrix (ECM) elements are key features contributing to vascular remodeling. Integrins, members of the cell adhesion receptor superfamily, are known to promote cell proliferation and survival through ECM binding. Despite the recognition of the role of ECM elements in vascular remodeling in PAH, the contribution of integrins remains poorly studied. We hypothesized that integrin signaling could promote PAH-PASMCs and PAH-PAECs proliferation and resistance to apoptosis contributing to vascular remodeling. Methods&Results: Using Western blot (WB) and Meso Scale Discovery, we found that α5β1 was upregulated in distal PAs, PA smooth muscle cells (PASMC) and PA endothelial cells (PAEC) from PAH patients compared to controls. Small molecule, antibody (M200), or siRNA-mediated inhibition of α5β1 decreased PAH-PASMC and PAH-PAEC proliferation (WB, MCM2 and Ki67 labeling), resistance to apoptosis (WB, Survivin and Annexin V labeling) and migration (scratch test assay). RNA sequencing analysis revealed that inhibition of α5β1 regulates a FOXM1-dependant gene network through the activation of focal adhesion kinase, resulting in mitotic defects (Immunofluorescence: α-tubulin and pericentrin labeling). In vivo , in both monocrotaline and Sugen/hypoxia rats with established PAH, inhibition of α5β1 using a small molecule inhibitor or a neutralizing antibody alone or in combination with macitentan and tadalafil improved hemodynamics (RHC and echocardiography: mean pulmonary arterial pressure, cardiac output, pulmonary artery acceleration time) and vascular remodeling (Elastica Van Gieson staining). Ex vivo , inhibition of α5β1 decreased vascular remodeling in human precision-cut lung slices (PCLS) from PAH patients and attenuated growth factors-induced vascular remodeling in control PCLS. Conclusion: Integrin α5β1 plays a key role in vascular remodeling in PAH and represents a novel therapeutic target.