Lineage tracing provides key insights into the fate of individual cells in complex organisms. Although effective genetic labeling approaches are available in model systems, in humans, most approaches require detection of nuclear somatic mutations, which have high error rates, limited scale, and do not capture cell state information. Here, we show that somatic mutations in mtDNA can be tracked by single-cell RNA or assay for transposase accessible chromatin (ATAC) sequencing. We leverage somatic mtDNA mutations as natural genetic barcodes and demonstrate their utility as highly accurate clonal markers to infer cellular relationships. We track native human cells both in vitro and in vivo and relate clonal dynamics to gene expression and chromatin accessibility. Our approach should allow clonal tracking at a 1,000-fold greater scale than with nuclear genome sequencing, with simultaneous information on cell state, opening the way to chart cellular dynamics in human health and disease.

Blood cell formation is classically thought to occur through a hierarchical differentiation process, although recent studies have shown that lineage commitment may occur earlier in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). The relevance to human blood diseases and the underlying regulation of these refined models remain poorly understood. By studying a genetic blood disorder, Diamond-Blackfan anemia (DBA), where the majority of mutations affect ribosomal proteins and the erythroid lineage is selectively perturbed, we are able to gain mechanistic insight into how lineage commitment is programmed normally and disrupted in disease. We show that in DBA, the pool of available ribosomes is limited, while ribosome composition remains constant. Surprisingly, this global reduction in ribosome levels more profoundly alters translation of a select subset of transcripts. We show how the reduced translation of select transcripts in HSPCs can impair erythroid lineage commitment, illuminating a regulatory role for ribosome levels in cellular differentiation.

Recent technological advances have enabled massively parallel chromatin profiling with scATAC-seq (single-cell assay for transposase accessible chromatin by sequencing). Here we present ATAC with select antigen profiling by sequencing (ASAP-seq), a tool to simultaneously profile accessible chromatin and protein levels. Our approach pairs sparse scATAC-seq data with robust detection of hundreds of cell surface and intracellular protein markers and optional capture of mitochondrial DNA for clonal tracking, capturing three distinct modalities in single cells. ASAP-seq uses a bridging approach that repurposes antibody:oligonucleotide conjugates designed for existing technologies that pair protein measurements with single-cell RNA sequencing. Together with DOGMA-seq, an adaptation of CITE-seq (cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing) for measuring gene activity across the central dogma of gene regulation, we demonstrate the utility of systematic multi-omic profiling by revealing coordinated and distinct changes in chromatin, RNA and surface proteins during native hematopoietic differentiation and peripheral blood mononuclear cell stimulation and as a combinatorial decoder and reporter of multiplexed perturbations in primary T cells. Chromatin accessibility, gene expression and protein levels are measured in the same single cell.

Ribosomal protein deficiency in Diamond-Blackfan anemia impairs protein translation of the key erythroid transcription factor GATA1. Ribosomal protein haploinsufficiency occurs in diverse human diseases including Diamond-Blackfan anemia (DBA)1,2, congenital asplenia3 and T cell leukemia4. Yet, how mutations in genes encoding ubiquitously expressed proteins such as these result in cell-type– and tissue-specific defects remains unknown5. Here, we identify mutations in GATA1, encoding the critical hematopoietic transcription factor GATA-binding protein-1, that reduce levels of full-length GATA1 protein and cause DBA in rare instances. We show that ribosomal protein haploinsufficiency, the more common cause of DBA, can lead to decreased GATA1 mRNA translation, possibly resulting from a higher threshold for initiation of translation of this mRNA in comparison with other mRNAs. In primary hematopoietic cells from patients with mutations in RPS19, encoding ribosomal protein S19, the amplitude of a transcriptional signature of GATA1 target genes was globally and specifically reduced, indicating that the activity, but not the mRNA level, of GATA1 is decreased in patients with DBA associated with mutations affecting ribosomal proteins. Moreover, the defective hematopoiesis observed in patients with DBA associated with ribosomal protein haploinsufficiency could be partially overcome by increasing GATA1 protein levels. Our results provide a paradigm by which selective defects in translation due to mutations affecting ubiquitous ribosomal proteins can result in human disease.

ABSTRACT Recent technological advances have enabled massively parallel chromatin profiling with s ingle- c ell A ssay for T ransposase A ccessible C hromatin by seq uencing (scATAC-seq) in thousands of individual cells. Here, we extend these approaches and present A TAC with S elect A ntigen P rofiling by seq uencing, ASAP-seq, a tool to simultaneously profile accessible chromatin and protein levels in thousands of single cells. Our approach pairs sparse scATAC-seq data with robust detection of hundreds of cell surface and intracellular protein markers and optional capture of mitochondrial DNA (mtDNA) for clonal tracking, thus concomitantly capturing three distinct modalities in single cells. Importantly, ASAP-seq uses a novel bridging approach that repurposes antibody:oligo conjugates designed for existing technologies that pair protein measurements with single cell RNA-seq. We demonstrate the utility of ASAP-seq by revealing coordinated and distinct changes in chromatin, RNA, and surface proteins during native hematopoietic differentiation, peripheral blood mononuclear cell stimulation, and as a combinatorial decoder and reporter of multiplexed perturbations in primary T cells.

Idiopathic aplastic anemia is a potentially lethal disease, characterized by T cell-mediated autoimmune attack of bone marrow hematopoietic stem cells. Standard of care therapies (stem cell transplantation or immunosuppression) are effective but associated with a risk of serious toxicities.An 18-year-old man presented with aplastic anemia in the context of a germline gain-of-function variant in STAT1. Treatment with the JAK1 inhibitor itacitinib resulted in a rapid resolution of aplastic anemia and a sustained recovery of hematopoiesis. Peripheral blood and bone marrow samples were compared before and after JAK1 inhibitor therapy.Following therapy, samples showed a decrease in the plasma concentration of interferon-γ, a decrease in PD1-positive exhausted CD8+ T cell population, and a decrease in an interferon responsive myeloid population. Single-cell analysis of chromatin accessibility showed decreased accessibility of STAT1 across CD4+ and CD8+ T cells, as well as CD14+ monocytes. To query whether other cases of aplastic anemia share a similar STAT1-mediated pathophysiology, we examined a cohort of 9 patients with idiopathic aplastic anemia. Bone marrow from six of nine patients also displayed abnormal STAT1 hyper-activation.These findings raise the possibility that STAT1 hyperactivition defines a subset of idiopathic aplastic anemia patients for whom JAK inhibition may be an efficacious therapy.Funding was provided by the Massachusetts General Hospital Department of Medicine Pathways Program and NIH T32 AI007387. A trial registration is at https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03906318.

Abstract Reconstructing lineage relationships in complex tissues can reveal mechanisms underlying development and disease. Recent methods combine single-cell transcriptomics with mitochondrial DNA variant detection to establish lineage relationships in primary human cells, but are not scalable to interrogate complex tissues. To overcome this limitation, here we develop a technology for high-confidence detection of mitochondrial mutations from high-throughput single-cell RNA-sequencing. We use the new method to identify skewed immune cell expansions in primary human clonal hematopoiesis.

Abstract Multi-modal measurements of single cell profiles are a powerful tool for characterizing cell states and regulatory mechanisms. While current methods allow profiling of RNA along with either chromatin or protein levels, connecting chromatin state to protein levels remains a barrier. Here, we developed PHAGE-ATAC, a method that uses engineered camelid single-domain antibody (‘nanobody’)-displaying phages for simultaneous single-cell measurement of surface proteins, chromatin accessibility profiles, and mtDNA-based clonal tracing through a massively parallel droplet-based assay of single-cell transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-seq). We demonstrate PHAGE-ATAC for multimodal analysis in primary human immune cells and for sample multiplexing. Finally, we construct a synthetic high-complexity phage library for selection of novel antigen-specific nanobodies that bind cells of particular molecular profiles, opening a new avenue for protein detection, cell characterization and screening with single-cell genomics.

Abstract Cells experience intrinsic and extrinsic pressures that affect their proclivity to expand and persist in vivo . In congenital disorders caused by loss-of-function mutations in mitochondrial DNA (mtDNA), metabolic vulnerabilities may result in cell-type specific phenotypes and depletion of pathogenic alleles, contributing to purifying selection. However, the impact of pathogenic mtDNA mutations on the cellular hematopoietic landscape is not well understood. Here, we establish a multi-omics approach to quantify deletions in mtDNA alongside cell state features in single cells derived from Pearson syndrome patients. We resolve the interdependence between pathogenic mtDNA and lineage, including purifying selection against deletions in effector/memory CD8 T-cell populations and recent thymic emigrants and dynamics in other hematopoietic populations. Our mapping of lineage-specific purifying selection dynamics in primary cells from patients carrying pathogenic heteroplasmy provides a new perspective on recurrent clinical phenotypes in mitochondrial disorders, including cancer and infection, with potential broader relevance to age-related immune dysfunction.