The inflammatory bowel diseases (IBDs), which include Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC), are multifactorial chronic conditions of the gastrointestinal tract. While IBD has been associated with dramatic changes in the gut microbiota, changes in the gut metabolome—the molecular interface between host and microbiota—are less well understood. To address this gap, we performed untargeted metabolomic and shotgun metagenomic profiling of cross-sectional stool samples from discovery (n = 155) and validation (n = 65) cohorts of CD, UC and non-IBD control patients. Metabolomic and metagenomic profiles were broadly correlated with faecal calprotectin levels (a measure of gut inflammation). Across >8,000 measured metabolite features, we identified chemicals and chemical classes that were differentially abundant in IBD, including enrichments for sphingolipids and bile acids, and depletions for triacylglycerols and tetrapyrroles. While > 50% of differentially abundant metabolite features were uncharacterized, many could be assigned putative roles through metabolomic ‘guilt by association’ (covariation with known metabolites). Differentially abundant species and functions from the metagenomic profiles reflected adaptation to oxidative stress in the IBD gut, and were individually consistent with previous findings. Integrating these data, however, we identified 122 robust associations between differentially abundant species and well-characterized differentially abundant metabolites, indicating possible mechanistic relationships that are perturbed in IBD. Finally, we found that metabolome- and metagenome-based classifiers of IBD status were highly accurate and, like the vast majority of individual trends, generalized well to the independent validation cohort. Our findings thus provide an improved understanding of perturbations of the microbiome–metabolome interface in IBD, including identification of many potential diagnostic and therapeutic targets. Using metabolomics and shotgun metagenomics on stool samples from individuals with and without inflammatory bowel disease, metabolites, microbial species and genes associated with disease were identified and validated in an independent cohort.

Functional profiles of microbial communities are typically generated using comprehensive metagenomic or metatranscriptomic sequence read searches, which are time-consuming, prone to spurious mapping, and often limited to community-level quantification. We developed HUMAnN2, a tiered search strategy that enables fast, accurate, and species-resolved functional profiling of host-associated and environmental communities. HUMAnN2 identifies a community’s known species, aligns reads to their pangenomes, performs translated search on unclassified reads, and finally quantifies gene families and pathways. Relative to pure translated search, HUMAnN2 is faster and produces more accurate gene family profiles. We applied HUMAnN2 to study clinal variation in marine metabolism, ecological contribution patterns among human microbiome pathways, variation in species’ genomic versus transcriptional contributions, and strain profiling. Further, we introduce ‘contributional diversity’ to explain patterns of ecological assembly across different microbial community types. HUMAnN2 uses a tiered sequence search to provide rapid and accurate species-level functional profiles of microbial communities from metagenomic and metatranscriptomic data.

Culture-independent analyses of microbial communities have progressed dramatically in the last decade, particularly due to advances in methods for biological profiling via shotgun metagenomics. Opportunities for improvement continue to accelerate, with greater access to multi-omics, microbial reference genomes, and strain-level diversity. To leverage these, we present bioBakery 3, a set of integrated, improved methods for taxonomic, strain-level, functional, and phylogenetic profiling of metagenomes newly developed to build on the largest set of reference sequences now available. Compared to current alternatives, MetaPhlAn 3 increases the accuracy of taxonomic profiling, and HUMAnN 3 improves that of functional potential and activity. These methods detected novel disease-microbiome links in applications to CRC (1262 metagenomes) and IBD (1635 metagenomes and 817 metatranscriptomes). Strain-level profiling of an additional 4077 metagenomes with StrainPhlAn 3 and PanPhlAn 3 unraveled the phylogenetic and functional structure of the common gut microbe Ruminococcus bromii , previously described by only 15 isolate genomes. With open-source implementations and cloud-deployable reproducible workflows, the bioBakery 3 platform can help researchers deepen the resolution, scale, and accuracy of multi-omic profiling for microbial community studies.

It is challenging to associate features such as human health outcomes, diet, environmental conditions, or other metadata to microbial community measurements, due in part to their quantitative properties. Microbiome multi-omics are typically noisy, sparse (zero-inflated), high-dimensional, extremely non-normal, and often in the form of count or compositional measurements. Here we introduce an optimized combination of novel and established methodology to assess multivariable association of microbial community features with complex metadata in population-scale observational studies. Our approach, MaAsLin 2 (Microbiome Multivariable Associations with Linear Models), uses generalized linear and mixed models to accommodate a wide variety of modern epidemiological studies, including cross-sectional and longitudinal designs, as well as a variety of data types (e.g., counts and relative abundances) with or without covariates and repeated measurements. To construct this method, we conducted a large-scale evaluation of a broad range of scenarios under which straightforward identification of meta-omics associations can be challenging. These simulation studies reveal that MaAsLin 2's linear model preserves statistical power in the presence of repeated measures and multiple covariates, while accounting for the nuances of meta-omics features and controlling false discovery. We also applied MaAsLin 2 to a microbial multi-omics dataset from the Integrative Human Microbiome (HMP2) project which, in addition to reproducing established results, revealed a unique, integrated landscape of inflammatory bowel diseases (IBD) across multiple time points and omics profiles.

We present QIIME 2, an open-source microbiome data science platform accessible to users spanning the microbiome research ecosystem, from scientists and engineers to clinicians and policy makers. QIIME 2 provides new features that will drive the next generation of microbiome research. These include interactive spatial and temporal analysis and visualization tools, support for metabolomics and shotgun metagenomics analysis, and automated data provenance tracking to ensure reproducible, transparent microbiome data science.

Inflammatory bowel disease (IBD) is a group of chronic diseases of the digestive tract that affects millions of people worldwide. Genetic, environmental and microbial factors have been implicated in the onset and exacerbation of IBD. However, the mechanisms associating gut microbial dysbioses and aberrant immune responses remain largely unknown. The integrative Human Microbiome Project seeks to close these gaps by examining the dynamics of microbiome functionality in disease by profiling the gut microbiomes of >100 individuals sampled over a 1-year period. Here, we present the first results based on 78 paired faecal metagenomes and metatranscriptomes, and 222 additional metagenomes from 59 patients with Crohn's disease, 34 with ulcerative colitis and 24 non-IBD control patients. We demonstrate several cases in which measures of microbial gene expression in the inflamed gut can be informative relative to metagenomic profiles of functional potential. First, although many microbial organisms exhibited concordant DNA and RNA abundances, we also detected species-specific biases in transcriptional activity, revealing predominant transcription of pathways by individual microorganisms per host (for example, by Faecalibacterium prausnitzii). Thus, a loss of these organisms in disease may have more far-reaching consequences than suggested by their genomic abundances. Furthermore, we identified organisms that were metagenomically abundant but inactive or dormant in the gut with little or no expression (for example, Dialister invisus). Last, certain disease-specific microbial characteristics were more pronounced or only detectable at the transcript level, such as pathways that were predominantly expressed by different organisms in patients with IBD (for example, Bacteroides vulgatus and Alistipes putredinis). This provides potential insights into gut microbial pathway transcription that can vary over time, inducing phenotypical changes that are complementary to those linked to metagenomic abundances. The study's results highlight the strength of analysing both the activity and the presence of gut microorganisms to provide insight into the role of the microbiome in IBD.

Abstract Metagenomic assembly enables new organism discovery from microbial communities, but it can only capture few abundant organisms from most metagenomes. Here we present MetaPhlAn 4, which integrates information from metagenome assemblies and microbial isolate genomes for more comprehensive metagenomic taxonomic profiling. From a curated collection of 1.01 M prokaryotic reference and metagenome-assembled genomes, we define unique marker genes for 26,970 species-level genome bins, 4,992 of them taxonomically unidentified at the species level. MetaPhlAn 4 explains ~20% more reads in most international human gut microbiomes and >40% in less-characterized environments such as the rumen microbiome and proves more accurate than available alternatives on synthetic evaluations while also reliably quantifying organisms with no cultured isolates. Application of the method to >24,500 metagenomes highlights previously undetected species to be strong biomarkers for host conditions and lifestyles in human and mouse microbiomes and shows that even previously uncharacterized species can be genetically profiled at the resolution of single microbial strains.

Abstract Metagenomic assembly enables novel organism discovery from microbial communities, but from most metagenomes it can only capture few abundant organisms. Here, we present a method - MetaPhlAn 4 - to integrate information from both metagenome assemblies and microbial isolate genomes for improved and more comprehensive metagenomic taxonomic profiling. From a curated collection of 1.01M prokaryotic reference and metagenome-assembled genomes, we defined unique marker genes for 26,970 species-level genome bins, 4,992 of them taxonomically unidentified at the species level. MetaPhlAn 4 explains ∼20% more reads in most international human gut microbiomes and >40% in less-characterized environments such as the rumen microbiome, and proved more accurate than available alternatives on synthetic evaluations while also reliably quantifying organisms with no cultured isolates. Application of the method to >24,500 metagenomes highlighted previously undetected species to be strong biomarkers for host conditions and lifestyles in human and mice microbiomes, and showed that even previously uncharacterized species can be genetically profiled at the resolution of single microbial strains. MetaPhlAn 4 thus integrates the novelty of metagenomic assemblies with the sensitivity and fidelity of reference-based analyses, providing efficient metagenomic profiling of uncharacterized species and enabling deeper and more comprehensive microbiome biomarker detection.

Abstract Modern biological screens yield enormous numbers of measurements, and identifying and interpreting statistically significant associations among features is essential. Here, we present a novel hierarchical framework, HAllA (Hierarchical All-against-All association testing), for structured association discovery between paired high-dimensional datasets. HAllA efficiently integrates hierarchical hypothesis testing with false discovery rate correction to reveal significant linear and non-linear block-wise relationships among continuous and/or categorical data. We optimized and evaluated HAllA using heterogeneous synthetic datasets of known association structure, where HAllA outperformed all-against-all and other block testing approaches across a range of common similarity measures. We then applied HAllA to a series of real-world multi-omics datasets, revealing new associations between gene expression and host immune activity, the microbiome and host transcriptome, metabolomic profiling, and human health phenotypes. An open-source implementation of HAllA is freely available at http://huttenhower.sph.harvard.edu/halla along with documentation, demo datasets, and a user group. Author Summary Modern scientific datasets increasingly include multiple measurements of many complementary data types. Here, we present HAllA, a method and implementation that overcomes the statistical challenges presented by data of this type by using feature similarity within each dataset to find statistically significant groups of features between them. We applied HAllA to simulated and real datasets, showing that HAllA outperformed existing procedures and identified compelling biological relationships. HAllA is widely applicable to diverse data structures and presents the user with grouped results that are easier to interpret than traditional methods.

Diet impacts human health, influencing body adiposity and the risk of developing cardiometabolic diseases. The gut microbiome is a key player in the diet-health axis, but while its bacterial fraction is widely studied, the role of micro-eukaryotes, including Blastocystis, is underexplored. We performed a global-scale analysis on 56,989 metagenomes and showed that human Blastocystis exhibits distinct prevalence patterns linked to geography, lifestyle, and dietary habits. Blastocystis presence defined a specific bacterial signature and was positively associated with more favorable cardiometabolic profiles and negatively with obesity (p < 1e–16) and disorders linked to altered gut ecology (p < 1e–8). In a diet intervention study involving 1,124 individuals, improvements in dietary quality were linked to weight loss and increases in Blastocystis prevalence (p = 0.003) and abundance (p < 1e–7). Our findings suggest a potentially beneficial role for Blastocystis, which may help explain personalized host responses to diet and downstream disease etiopathogenesis.