Resolving genomic structural variation Many human genomes have been reported using short-read technology, but it is difficult to resolve structural variants (SVs) using these data. These genomes thus lack comprehensive comparisons among individuals and populations. Ebert et al. used long-read structural variation calling across 64 human genomes representing diverse populations and developed new methods for variant discovery. This approach allowed the authors to increase the number of confirmed SVs and to describe the patterns of variation across populations. From this dataset, they identified quantitative trait loci affected by these SVs and determined how they may affect gene expression and potentially explain genome-wide association study hits. This information provides insights into patterns of normal human genetic variation and generates reference genomes that better represent the diversity of our species. Science , this issue p. eabf7117

The 1000 Genomes Project (1kGP) is the largest fully open resource of whole-genome sequencing (WGS) data consented for public distribution without access or use restrictions. The final, phase 3 release of the 1kGP included 2,504 unrelated samples from 26 populations and was based primarily on low-coverage WGS. Here, we present a high-coverage 3,202-sample WGS 1kGP resource, which now includes 602 complete trios, sequenced to a depth of 30X using Illumina. We performed single-nucleotide variant (SNV) and short insertion and deletion (INDEL) discovery and generated a comprehensive set of structural variants (SVs) by integrating multiple analytic methods through a machine learning model. We show gains in sensitivity and precision of variant calls compared to phase 3, especially among rare SNVs as well as INDELs and SVs spanning frequency spectrum. We also generated an improved reference imputation panel, making variants discovered here accessible for association studies.

Abstract Here the Human Pangenome Reference Consortium presents a first draft of the human pangenome reference. The pangenome contains 47 phased, diploid assemblies from a cohort of genetically diverse individuals 1 . These assemblies cover more than 99% of the expected sequence in each genome and are more than 99% accurate at the structural and base pair levels. Based on alignments of the assemblies, we generate a draft pangenome that captures known variants and haplotypes and reveals new alleles at structurally complex loci. We also add 119 million base pairs of euchromatic polymorphic sequences and 1,115 gene duplications relative to the existing reference GRCh38. Roughly 90 million of the additional base pairs are derived from structural variation. Using our draft pangenome to analyse short-read data reduced small variant discovery errors by 34% and increased the number of structural variants detected per haplotype by 104% compared with GRCh38-based workflows, which enabled the typing of the vast majority of structural variant alleles per sample.

A key goal of whole-genome sequencing for studies of human genetics is to interrogate all forms of variation, including single-nucleotide variants, small insertion or deletion (indel) variants and structural variants. However, tools and resources for the study of structural variants have lagged behind those for smaller variants. Here we used a scalable pipeline1 to map and characterize structural variants in 17,795 deeply sequenced human genomes. We publicly release site-frequency data to create the largest, to our knowledge, whole-genome-sequencing-based structural variant resource so far. On average, individuals carry 2.9 rare structural variants that alter coding regions; these variants affect the dosage or structure of 4.2 genes and account for 4.0–11.2% of rare high-impact coding alleles. Using a computational model, we estimate that structural variants account for 17.2% of rare alleles genome-wide, with predicted deleterious effects that are equivalent to loss-of-function coding alleles; approximately 90% of such structural variants are noncoding deletions (mean 19.1 per genome). We report 158,991 ultra-rare structural variants and show that 2% of individuals carry ultra-rare megabase-scale structural variants, nearly half of which are balanced or complex rearrangements. Finally, we infer the dosage sensitivity of genes and noncoding elements, and reveal trends that relate to element class and conservation. This work will help to guide the analysis and interpretation of structural variants in the era of whole-genome sequencing. Structural variants in more than 17,000 human genomes are mapped and characterized using whole-genome sequencing, showing how this type of variation contributes to rare deleterious coding and noncoding alleles.

Pangenome references address biases of reference genomes by storing a representative set of diverse haplotypes and their alignment, usually as a graph. Alternate alleles determined by variant callers can be used to construct pangenome graphs, but advances in long-read sequencing are leading to widely available, high-quality phased assemblies. Constructing a pangenome graph directly from assemblies, as opposed to variant calls, leverages the graph’s ability to represent variation at different scales. Here we present the Minigraph-Cactus pangenome pipeline, which creates pangenomes directly from whole-genome alignments, and demonstrate its ability to scale to 90 human haplotypes from the Human Pangenome Reference Consortium. The method builds graphs containing all forms of genetic variation while allowing use of current mapping and genotyping tools. We measure the effect of the quality and completeness of reference genomes used for analysis within the pangenomes and show that using the CHM13 reference from the Telomere-to-Telomere Consortium improves the accuracy of our methods. We also demonstrate construction of a Drosophila melanogaster pangenome. Constructing genome graphs directly from genome assemblies overcomes single-reference bias.

Abstract The current human reference genome, GRCh38, represents over 20 years of effort to generate a high-quality assembly, which has greatly benefited society 1, 2 . However, it still has many gaps and errors, and does not represent a biological human genome since it is a blend of multiple individuals 3, 4 . Recently, a high-quality telomere-to-telomere reference genome, CHM13, was generated with the latest long-read technologies, but it was derived from a hydatidiform mole cell line with a duplicate genome, and is thus nearly homozygous 5 . To address these limitations, the Human Pangenome Reference Consortium (HPRC) recently formed with the goal of creating a collection of high-quality, cost-effective, diploid genome assemblies for a pangenome reference that represents human genetic diversity 6 . Here, in our first scientific report, we determined which combination of current genome sequencing and automated assembly approaches yields the most complete, accurate, and cost-effective diploid genome assemblies with minimal manual curation. Approaches that used highly accurate long reads and parent-child data to sort haplotypes during assembly outperformed those that did not. Developing a combination of all the top performing methods, we generated our first high- quality diploid reference assembly, containing only ∼4 gaps (range 0-12) per chromosome, most within + 1% of CHM13’s length. Nearly 1/4th of protein coding genes have synonymous amino acid changes between haplotypes, and centromeric regions showed the highest density of variation. Our findings serve as a foundation for assembling near-complete diploid human genomes at the scale required for constructing a human pangenome reference that captures all genetic variation from single nucleotides to large structural rearrangements.

Abstract Long-read and strand-specific sequencing technologies together facilitate the de novo assembly of high-quality haplotype-resolved human genomes without parent–child trio data. We present 64 assembled haplotypes from 32 diverse human genomes. These highly contiguous haplotype assemblies (average contig N50: 26 Mbp) integrate all forms of genetic variation across even complex loci such as the major histocompatibility complex. We focus on 107,590 structural variants (SVs), of which 68% are inaccessible by short-read sequencing. We identify new SV hotspots (spanning megabases of gene-rich sequence), characterize 130 of the most active mobile element source elements, and find that 63% of all SVs arise by homology-mediated mechanisms—a twofold increase from previous studies. Our resource now enables reliable graph-based genotyping from short reads of up to 50,340 SVs, resulting in the identification of 1,525 expression quantitative trait loci (SV-eQTLs) as well as SV candidates for adaptive selection within the human population.

Hundreds of thousands of human whole genome sequencing (WGS) datasets will be generated over the next few years to interrogate a broad range of traits, across diverse populations. These data are more valuable in aggregate: joint analysis of genomes from many sources increases sample size and statistical power for trait mapping, and will enable studies of genome biology, population genetics and genome function at unprecedented scale. A central challenge for joint analysis is that different WGS data processing and analysis pipelines cause substantial batch effects in combined datasets, necessitating computationally expensive reprocessing and harmonization prior to variant calling. This approach is no longer tenable given the scale of current studies and data volumes. Here, in a collaboration across multiple genome centers and NIH programs, we define WGS data processing standards that allow different groups to produce "functionally equivalent" (FE) results suitable for joint variant calling with minimal batch effects. Our approach promotes broad harmonization of upstream data processing steps, while allowing for diverse variant callers. Importantly, it allows each group to continue innovating on data processing pipelines, as long as results remain compatible. We present initial FE pipelines developed at five genome centers and show that they yield similar variant calling results — including single nucleotide (SNV), insertion/deletion (indel) and structural variation (SV) — and produce significantly less variability than sequencing replicates. Residual inter-pipeline variability is concentrated at low quality sites and repetitive genomic regions prone to stochastic effects. This work alleviates a key technical bottleneck for genome aggregation and helps lay the foundation for broad data sharing and community-wide "big-data" human genetics studies.

SUMMARY The 1000 Genomes Project (1kGP) is the largest fully open resource of whole genome sequencing (WGS) data consented for public distribution of raw sequence data without access or use restrictions. The final release of the 1kGP included 2,504 unrelated samples from 26 populations and was based primarily on low coverage WGS. Here, we present a new, high coverage 3,202-sample WGS 1kGP resource, sequenced to a targeted depth of 30X using the Illumina NovaSeq 6000 system, which now includes 602 complete trios. We performed SNV/INDEL calling against the GRCh38 reference using GATK’s HaplotypeCaller, and generated a comprehensive set of SVs by integrating multiple analytic methods through a sophisticated machine learning model. We make all the data generated as part of this project publicly available and we envision it to become the new de facto public resource for the worldwide genomics and genetics community.