Since its initial release in 2000, the human reference genome has covered only the euchromatic fraction of the genome, leaving important heterochromatic regions unfinished. Addressing the remaining 8% of the genome, the Telomere-to-Telomere (T2T) Consortium presents a complete 3.055 billion–base pair sequence of a human genome, T2T-CHM13, that includes gapless assemblies for all chromosomes except Y, corrects errors in the prior references, and introduces nearly 200 million base pairs of sequence containing 1956 gene predictions, 99 of which are predicted to be protein coding. The completed regions include all centromeric satellite arrays, recent segmental duplications, and the short arms of all five acrocentric chromosomes, unlocking these complex regions of the genome to variational and functional studies.

Abstract The current human reference genome, GRCh38, represents over 20 years of effort to generate a high-quality assembly, which has greatly benefited society 1, 2 . However, it still has many gaps and errors, and does not represent a biological human genome since it is a blend of multiple individuals 3, 4 . Recently, a high-quality telomere-to-telomere reference genome, CHM13, was generated with the latest long-read technologies, but it was derived from a hydatidiform mole cell line with a duplicate genome, and is thus nearly homozygous 5 . To address these limitations, the Human Pangenome Reference Consortium (HPRC) recently formed with the goal of creating a collection of high-quality, cost-effective, diploid genome assemblies for a pangenome reference that represents human genetic diversity 6 . Here, in our first scientific report, we determined which combination of current genome sequencing and automated assembly approaches yields the most complete, accurate, and cost-effective diploid genome assemblies with minimal manual curation. Approaches that used highly accurate long reads and parent-child data to sort haplotypes during assembly outperformed those that did not. Developing a combination of all the top performing methods, we generated our first high- quality diploid reference assembly, containing only ∼4 gaps (range 0-12) per chromosome, most within + 1% of CHM13’s length. Nearly 1/4th of protein coding genes have synonymous amino acid changes between haplotypes, and centromeric regions showed the highest density of variation. Our findings serve as a foundation for assembling near-complete diploid human genomes at the scale required for constructing a human pangenome reference that captures all genetic variation from single nucleotides to large structural rearrangements.

Abstract The kākāpō is a critically endangered, intensively managed, long-lived nocturnal parrot endemic to Aotearoa New Zealand. We generated and analyzed whole-genome sequence data for nearly all individuals living in early 2018 (169 individuals) to generate a high-quality species-wide genetic variant callset. We leverage extensive long-term metadata to quantify genome-wide diversity of the species over time and present new approaches using probabilistic programming, combined with a phenotype dataset spanning five decades, to disentangle phenotypic variance into environmental and genetic effects while quantifying uncertainty in small populations. We find associations for growth, disease susceptibility, clutch size, and egg fertility within genic regions previously shown to influence these traits in other species. Finally, we generate breeding values to predict phenotype and illustrate that active management over the past 45 years has maintained both genome-wide diversity and diversity in breeding values, and hence, evolutionary potential. We provide new pathways for informing future conservation management decisions for kākāpō, including prioritizing individuals for translocation and monitoring individuals with poor growth or high disease risk. Overall, by explicitly addressing the challenge of small sample size, we provide a template for the inclusion of genomic data that will be transformational for species recovery efforts around the globe.

Improvements in genome sequencing and assembly are enabling high-quality reference genomes for all species. However, the assembly process is still laborious, computationally and technically demanding, lacks standards for reproducibility, and is not readily scalable. Here we present the latest Vertebrate Genomes Project assembly pipeline and demonstrate that it delivers high-quality reference genomes at scale across a set of vertebrate species arising over the last ~500 million years. The pipeline is versatile and combines PacBio HiFi long-reads and Hi-C-based haplotype phasing in a new graph-based paradigm. Standardized quality control is performed automatically to troubleshoot assembly issues and assess biological complexities. We make the pipeline freely accessible through Galaxy, accommodating researchers even without local computational resources and enhanced reproducibility by democratizing the training and assembly process. We demonstrate the flexibility and reliability of the pipeline by assembling reference genomes for 51 vertebrate species from major taxonomic groups (fish, amphibians, reptiles, birds, and mammals).

Abstract Vocal learning is a skilled motor behavior observed in several mammalian and avian species and is critical for human speech. While convergent gene expression patterns have highlighted similar primary motor and striatal pathways for vocal imitation in songbirds and humans, the extent of molecular and circuit convergence remains unresolved. Here we profiled the four principal song nuclei of the zebra finch (HVC, LMAN, RA, Area X) and their surrounding brain regions using RNA-Seq and compared them with specialized markers we identified for human speech brain regions. Expanding previous work, both songbird RA and HVC exhibited convergent specialized gene expression of ∼350 genes with human laryngeal sensorimotor cortex. The songbird HVC RA intratelencephalic (IT) neurons were the predominant cell type that was convergent with human, specifically layer 2/3 IT neurons, while the songbird RA extratelencephalic (ET) projection neurons exhibited convergent expression with human layer 5 ET projection neurons. The molecular specializations of both songbird LMAN and human Broca’s area were more unique to each species. These findings demonstrate the extent of convergent molecular specializations in distantly related species for vocal imitation and emphasize important evolutionary constraints for this complex trait. One-Sentence Summary Our data provide hundreds of candidate genes to study the molecular basis and evolution of song and speech across species.

Abstract Studies in vertebrate genomics require sampling from a broad range of tissue types, taxa, and localities. Recent advancements in long-read and long-range genome sequencing have made it possible to produce high-quality chromosome-level genome assemblies for almost any organism. However, adequate tissue preservation for the requisite ultra-high molecular weight DNA (uHMW DNA) remains a major challenge. Here we present a comparative study of preservation methods for field and laboratory tissue sampling, across vertebrate classes and different tissue types. We find that no single method is best for all cases. Instead, the optimal storage and extraction methods vary by taxa, by tissue, and by down-stream application. Therefore, we provide sample preservation guidelines that ensure sufficient DNA integrity and amount required for use with long-read and long-range sequencing technologies across vertebrates. Our best practices generated the uHMW DNA needed for the high-quality reference genomes for Phase 1 of the Vertebrate Genomes Project (VGP), whose ultimate mission is to generate chromosome-level reference genome assemblies of all ∼70,000 extant vertebrate species.

Reference quality genomes are expected to provide a resource for studying gene structure and function. However, often genes of interest are not completely or accurately assembled, leading to unknown errors in analyses or additional cloning efforts for the correct sequences. A promising solution to this problem is long-read sequencing. Here we tested PacBio-based long-read sequencing and diploid assembly for potential improvements to the Sanger-based intermediate-read zebra finch reference and Illumina-based short-read Anna??s hummingbird reference, two vocal learning avian species widely studied in neuroscience and genomics. With DNA of the same individuals used to generate the reference genomes, we generated diploid assemblies with the FALCON-Unzip assembler, resulting in contigs with no gaps in the megabase range (N50s of 5.4 and 7.7 Mb, respectively), and representing 150-fold and 200-fold improvements over the current zebra finch and hummingbird references, respectively. These long-read assemblies corrected and resolved what we discovered to be misassemblies, including due to erroneous sequences flanking gaps, complex repeat structure errors in the references, base call errors in difficult to sequence regions, and inaccurate resolution of allelic differences between the two haplotypes. We analyzed protein-coding genes widely studied in neuroscience and specialized in vocal learning species, and found numerous assembly and sequence errors in the reference genes that the PacBio-based assemblies resolved completely, validated by single long genomic reads and transcriptome reads. These findings demonstrate, for the first time in non-human vocal learning species, the impact of higher quality, phased and gap-less assemblies for understanding gene structure and function.

Abstract In 2001, Celera Genomics and the International Human Genome Sequencing Consortium published their initial drafts of the human genome, which revolutionized the field of genomics. While these drafts and the updates that followed effectively covered the euchromatic fraction of the genome, the heterochromatin and many other complex regions were left unfinished or erroneous. Addressing this remaining 8% of the genome, the Telomere-to-Telomere (T2T) Consortium has finished the first truly complete 3.055 billion base pair (bp) sequence of a human genome, representing the largest improvement to the human reference genome since its initial release. The new T2T-CHM13 reference includes gapless assemblies for all 22 autosomes plus Chromosome X, corrects numerous errors, and introduces nearly 200 million bp of novel sequence containing 2,226 paralogous gene copies, 115 of which are predicted to be protein coding. The newly completed regions include all centromeric satellite arrays and the short arms of all five acrocentric chromosomes, unlocking these complex regions of the genome to variational and functional studies for the first time.

Abstract The Rock Ptarmigan ( Lagopus muta ) is a cold-adapted, largely sedentary, game bird with a Holarctic distribution. The species represents an important example of an organism likely to be affected by ongoing climatic shifts across a disparate range. We provide here a high-quality reference genome and mitogenome for the Rock Ptarmigan assembled from PacBio HiFi and Hi-C sequencing of a female bird from Iceland. The total size of the genome is 1.03 Gb with a scaffold N50 of 71.23 Mb and a contig N50 of 17.91 Mb. The final scaffolds represent all 40 predicted chromosomes, and the mitochondria with a BUSCO score of 98.6%. Gene annotation resulted in 16,078 protein-coding genes out of a total 19,831 predicted (81.08% excluding pseudogenes). The genome included 21.07% repeat sequences, and the average length of genes, exons, and introns were, 33605, 394, and 4265 bp respectively. The availability of a new reference-quality genome will contribute to understanding the Rock Ptarmigan’s unique evolutionary history, vulnerability to climate change, and demographic trajectories around the globe and serve as a reference genome for the species in the family Tetraonidae (order Galliformes).

Animals living in caves are of broad relevance to evolutionary biologists interested in understanding the mechanisms underpinning convergent evolution. In the Eastern Andes of Colombia, populations from at least two distinct clades of Trichomycterus catfishes (Siluriformes) independently colonized cave environments and converged in phenotype by losing their eyes and pigmentation. We are pursuing several research questions using genomics to understand the evolutionary forces and molecular mechanisms responsible for repeated morphological changes in this system. As a foundation for such studies, here we describe a diploid, chromosome-scale, long-read reference genome for Trichomycterus rosablanca, a blind, depigmented species endemic to the karstic system of the department of Santander. The nuclear genome comprises 1Gb in 27 chromosomes, with a 40.0x HiFi long-read genome coverage having a N50 scaffold of 40.4 Mb and N50 contig of 13.1 Mb, with 96.9% (Eukaryota) and 95.4% (Actinopterygii) universal single-copy orthologs (BUSCO). This assembly provides the first reference genome for the speciose genus Trichomycterus, which will serve as a key resource for research on the genomics of phenotypic evolution.