Abstract To understand the brain we must relate neurons’ functional responses to the circuit architecture that shapes them. Here, we present a large functional connectomics dataset with dense calcium imaging of a millimeter scale volume. We recorded activity from approximately 75,000 neurons in primary visual cortex (VISp) and three higher visual areas (VISrl, VISal and VISlm) in an awake mouse viewing natural movies and synthetic stimuli. The functional data were co-registered with a volumetric electron microscopy (EM) reconstruction containing more than 200,000 cells and 0.5 billion synapses. Subsequent proofreading of a subset of neurons in this volume yielded reconstructions that include complete dendritic trees as well the local and inter-areal axonal projections that map up to thousands of cell-to-cell connections per neuron. Here, we release this dataset as an open-access resource to the scientific community including a set of tools that facilitate data retrieval and downstream analysis. In accompanying papers we describe our findings using the dataset to provide a comprehensive structural characterization of cortical cell types 1–3 and the most detailed synaptic level connectivity diagram of a cortical column to date 2 , uncovering unique cell-type specific inhibitory motifs that can be linked to gene expression data 4 . Functionally, we identify new computational principles of how information is integrated across visual space 5 , characterize novel types of neuronal invariances 6 and bring structure and function together to decipher a general principle that wires excitatory neurons within and across areas 7, 8 .

In primates and most carnivores, neurons in primary visual cortex are spatially organized by their functional properties. For example, neurons with similar orientation preferences are grouped together in iso-orientation domains that smoothly vary over the cortical sheet. In rodents, on the other hand, neurons with different orientation preferences are thought to be spatially intermingled, a feature which has been termed "salt-and-pepper" organization. The apparent absence of any systematic structure in orientation tuning has been considered a defining feature of the rodent visual system for more than a decade, with broad implications for brain development, visual processing, and comparative neurophysiology. Here, we revisited this question using new techniques for wide-field two-photon calcium imaging that enabled us to collect nearly complete population tuning preferences in layers 2-4 across a large fraction of the mouse visual hierarchy. Examining the orientation tuning of these hundreds of thousands of neurons, we found a global map spanning multiple visual cortical areas in which orientation bias was organized around a single pinwheel centered in V1. This pattern was consistent across animals and cortical depth. The existence of this global organization in rodents has implications for our understanding of visual processing and the principles governing the ontogeny and phylogeny of the visual cortex of mammals.

Recording and analysis of neural activity is often biased toward detecting sparse subsets of highly active neurons, masking important signals carried in low magnitude and variable responses. To investigate the contribution of seemingly noisy activity to odor encoding, we used mesoscale calcium imaging from mice of both sexes to record odor responses from the dorsal surface of bilateral olfactory bulbs (OBs). The outer layer of the mouse OB is comprised of dendrites organized into discrete “glomeruli”, which are defined by odor receptor-specific sensory neuron input. We extracted activity from a large population of glomeruli and used logistic regression to classify odors from individual trials with high accuracy. We then used add-in and drop-out analyses to determine subsets of glomeruli necessary and sufficient for odor classification. Classifiers successfully predicted odor identity even after excluding sparse, highly active glomeruli, indicating that odor information is redundantly represented across a large population of glomeruli. Additionally, we found that Random Forest feature selection informed by Gini Inequality (RFGI) reliably ranked glomeruli by their contribution to overall odor classification. RFGI provided a measure of “feature importance” for each glomerulus that correlated with intuitive features like response magnitude. Finally, in agreement with previous work, we found that odor information persists in glomerular activity after odor offset. Together, our findings support a model of olfactory bulb odor coding where sparse activity is sufficient for odor identification, but information is widely, redundantly available across a large population of glomeruli, with each glomerulus representing information about more than one odor. Significance statement This study leverages meso-scale imaging and machine learning to investigate how odor information is first represented in the brain. Typically, recordings of neuronal activity focus on active individual cells, potentially overlooking broader variations in neuronal responses across populations. Our results demonstrate that a considerable amount of olfactory information is redundantly distributed across a large proportion of olfactory bulb glomeruli. Even after excluding a majority of glomeruli, odor identification remained possible. These findings indicate that, although a few glomeruli are sufficient for odor recognition, an abundance of additional information is represented across a broad population. Understanding how the brain manages redundant olfactory information will shed light on its adaptive mechanisms for navigating diverse real-world circumstances and responding to fluctuating internal states.

Even under spontaneous conditions and in the absence of changing environmental demands, awake animals alternate between moments of increased alertness and moments of torpor or disengagement. These changes in brain state can occur rapidly, on a timescale of seconds, and may be correlated with overt changes in exploratory behaviors (walking and whisking) or they may be more covert, with no external correlates except for changes in pupil size. Neuromodulators such as acetylcholine (ACh) are thought to play an important role in driving these spontaneous state transitions, and cholinergic activity in cortex has been monitored via calcium imaging of cholinergic axons and with new genetically-encoded fluorescent neuromodulator sensors. Here, we perform the first simultaneous imaging of sensors and axons in vivo, to examine the spatiotemporal properties of cortical acetylcholine (ACh) release during spontaneous changes in behavioral state. As has been previously reported, periods of locomotion were accompanied by large increases in ACh levels across the dorsal cortex, and pupil size tracked smaller, more rapid changes in ACh during periods of quiescence. We observed a high correlation between simultaneously-recorded basal forebrain axon activity and neuromodulator sensor fluorescence. Consistent with volume transmission of ACh, increases in axon activity resulted in increases in local ACh levels that fell off with the distance from the nearest axon. GRAB-ACh fluorescence could be accurately predicted from axonal activity alone, providing the first validation that neuromodulator axon activity is a reliable proxy for nearby neuromodulator levels. To more precisely understand the temporal kinetics of ACh, we applied a deconvolution approach to account for the kinetics of the ACh sensor. Deconvolution of fluorescence traces emphasized the rapid clearance of ACh, especially for smaller transients outside of running periods. Finally, we trained a predictive model of ACh fluctuations from the combination of pupil size and running speed; this model performed better than using either variable alone, and generalized well to unseen data. Overall, these results contribute to a growing understanding of the precise timing and spatial characteristics of cortical ACh during fast brain state transitions under spontaneous conditions.

Interpreting chemical information and translating it into ethologically relevant output is a common challenge of olfactory systems across species. Are computations performed by olfactory circuits conserved across species to overcome these common challenges? To understand this, we compared odor responses in the locust antennal lobe (AL) and mouse olfactory bulb (OB). We found that odors activated nearly mutually exclusive neural ensembles during stimulus presentation ('ON response') and after stimulus termination ('OFF response'). Strikingly, ON and OFF responses evoked by a single odor were anticorrelated with each other. 'Inverted' OFF responses enhanced contrast between odors experienced close together in time. Notably, OFF responses persisted long after odor termination in both AL and OB networks, indicating a form of short-term memory. Taken together, our results reveal key neurodynamic features underlying olfactory computations that are conserved across insect and mammalian olfactory systems.