SARS-CoV-2 variants of interest and concern will continue to emerge for the duration of the COVID-19 pandemic. To map mutations in the receptor-binding domain (RBD) of the spike protein that affect binding to angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), the receptor for SARS-CoV-2, we applied in vitro evolution to affinity-mature the RBD. Multiple rounds of random mutagenic libraries of the RBD were sorted against decreasing concentrations of ACE2, resulting in the selection of higher affinity RBD binders. We found that mutations present in more transmissible viruses (S477N, E484K and N501Y) were preferentially selected in our high-throughput screen. Evolved RBD mutants include prominently the amino acid substitutions found in the RBDs of B.1.620, B.1.1.7 (Alpha), B1.351 (Beta) and P.1 (Gamma) variants. Moreover, the incidence of RBD mutations in the population as presented in the GISAID database (April 2021) is positively correlated with increased binding affinity to ACE2. Further in vitro evolution increased binding by 1,000-fold and identified mutations that may be more infectious if they evolve in the circulating viral population, for example, Q498R is epistatic to N501Y. We show that our high-affinity variant RBD-62 can be used as a drug to inhibit infection with SARS-CoV-2 and variants Alpha, Beta and Gamma in vitro. In a model of SARS-CoV-2 challenge in hamster, RBD-62 significantly reduced clinical disease when administered before or after infection. A 2.9 Å cryo-electron microscopy structure of the high-affinity complex of RBD-62 and ACE2, including all rapidly spreading mutations, provides a structural basis for future drug and vaccine development and for in silico evaluation of known antibodies. Evolution of the SARS-CoV-2 spike protein receptor-binding domain in vitro recapitulates SARS-CoV-2 variant emergence and produces an effective antiviral spike receptor-binding domain variant.

Summary Allostery is a pervasive principle to regulate protein function. Here, we show that DNA also transmits allosteric signals over long distances to boost the binding cooperativity of transcription factors. Phenotype switching in Bacillus subtilis requires an all-or-none promoter binding of multiple ComK proteins. Using single-molecule FRET, we find that ComK-binding at one promoter site increases affinity at a distant site. Cryo-EM structures of the complex between ComK and its promoter demonstrate that this coupling is due to mechanical forces that alter DNA curvature. Modifications of the spacer between sites tune cooperativity and show how to control allostery, which paves new ways to design the dynamic properties of genetic circuits.

Abstract Accurate and regulated protein targeting to organelles is crucial for eukaryotic cellular function and homeostasis. This has driven the evolution of targeting signals on proteins and the targeting factors that recognize them. One example for this is peroxisomal matrix proteins, the majority of which rely on the targeting factor Pex5 to correctly localize and function. While most Pex5 cargos contain a Peroxisomal Targeting Signal type 1 (PTS1), in recent years it has become clear that more binding interfaces exist, and that targeting by Pex5 is more complex than previously thought. Here, we uncover that the matrix protein Eci1 can reach peroxisomes in the absence of its PTS1. By solving the structure of a complex between full length yeast Pex5 and Eci1 using Cryo-Electron Microscopy, we could identify their binding interfaces. This allowed us to map an additional binding interface that is independent of the canonical PTS1-mediated binding site. Our work brings forward a solution to a long-standing mystery regarding Eci1 targeting to peroxisomes. More globally, it demonstrates the intricate and complex nature of organelle targeting and how it has evolved to serve the complex eukaryotic environment.

Fatty acid synthase 1 (FAS I) from Mycobacterium. tuberculosis (Mtb) is an essential protein and a promising drug target. FAS I is a multi-functional, multi-domain protein that is organized as a large (1.9 MDa) homohexameric complex. Acyl intermediates produced during fatty acid elongation are attached covalently to an acyl carrier protein (ACP) domain. This domain is activated by the transfer of a 4'-Phosphopantetheine (4'-PP, also termed P-pant) group from CoA to ACP catalyzed by a 4'-PP transferase, termed acyl carrier protein synthase (AcpS). In order to obtain an activated FAS I in E. coli, we transformed E. coli with tagged Mtb fas1 and acpS genes encoded by a separate plasmid. We induced the expression of Mtb FAS I following induction of AcpS expression. FAS I was purified by Strep-Tactin affinity chromatography. Activation of Mtb FAS I was confirmed by the identification of a bound P-pant group on serine at position 1808 by mass spectrometry. The purified FAS I displayed biochemical activity shown by spectrophotometric analysis of NADPH oxidation and by CoA production, using the Ellman reaction. The purified Mtb FAS I forms a hexameric complex shown by negative staining and cryo-EM. Purified hexameric and active Mtb FAS I is required for binding and drug inhibition studies and for structure-function analysis of this enzyme. This relatively simple and short procedure for Mtb FAS I production should facilitate studies of this enzyme.

Summary Multi-enzyme assemblies composed of metabolic enzymes catalyzing sequential reactions are being increasingly studied. Here, we report the discovery of a 1.6 megadalton multi-enzyme complex from Bacillus subtilis composed of two enzymes catalyzing opposite rather than sequential reactions (“counter-enzymes”): glutamate synthase (GltAB), and glutamate dehydrogenase (GudB), that make and break glutamate, respectively. In vivo and in vitro studies show that the primary role of complex formation is to inhibit GudB’s activity as this enzyme is constitutively expressed including in glutamate-limiting conditions. Using cryo-electron microscopy, we elucidated the structure of the complex and the basis of GudB’s inhibition. Finally, we show that this complex that exhibits unusual oscillatory progress curves is a necessity for planktonic growth in glutamate-limiting conditions, but is also essential for biofilm growth in glutamate-rich media, suggesting a regulatory role at fluctuating glutamate concentrations.

Abstract Diatoms are unicellular algae, characterized by silica cell walls. The silica elements are formed intracellularly in a membrane-bound silica deposition vesicle (SDV), and are exocytosed after completion. How diatoms maintain membrane homeostasis during the exocytosis of these large and rigid silica elements is a long-standing enigma. We studied membrane dynamics during cell wall formation and exocytosis in two model diatom species, using live-cell confocal microscopy, transmission electron microscopy and cryo-electron tomography. Our results show that during the formation of the mineral phase it is in tight association with the SDV membranes, which are forming a precise mold of the delicate geometrical patterns. During exocytosis, the distal SDV membrane and the plasma membrane gradually detach from the mineral and disintegrate in the extracellular space, without any noticeable endocytic retrieval or extracellular repurposing. Within the cell, there is no evidence for the formation of a new plasma membrane, thus the proximal SDV membrane becomes the new barrier between the cell and its environment, and assumes the role of a new plasma membrane. These results provide direct structural observations of diatom silica exocytosis, and point to an extraordinary mechanism in which membrane homeostasis is maintained by discarding, rather than recycling, significant membrane patches. Significance Statement Exocytosis is a fundamental process for cell metabolism, communication, and growth. During exocytosis, an intracellular vesicle fuses with the plasma membrane to release its contents. In classical exocytosis, where the exocytosed vesicles are much smaller than the cell, membrane homeostasis is maintained by recycling excess membranes back into the cell. However, an extreme case of exocytosis is the extrusion of large and rigid cell wall elements by unicellular marine algae. During this process, the cell needs to deal with a potential doubling of its plasma membrane. This study reports on a unique exocytosis mechanism used by these organisms, in which the cells cope with the geometrical and physical challenges of exocytosis by releasing a significant amount of membranes to the extracellular space.

The respiratory and intestinal tracts are exposed to physical and biological hazards accompanying the intake of air and food. Likewise, the vasculature is threatened by inflammation and trauma. Mucin glycoproteins and the related von Willebrand factor (VWF) guard the vulnerable cell layers in these diverse systems. Colon mucins additionally house and feed the gut microbiome. Here we present an integrated structural analysis of multimerized intestinal mucin MUC2. Our findings reveal the shared mechanism by which complex macromolecules responsible for blood clotting, mucociliary clearance, and the intestinal mucosal barrier form protective polymers and hydrogels. Specifically, cryo-electron microscopy and crystal structures show how disulfide-rich bridges and pH-tunable interfaces control successive assembly steps in the endoplasmic reticulum and Golgi. Remarkably, a densely O-glycosylated mucin domain performs a specific organizational role in MUC2. The mucin assembly mechanism and its adaptation for hemostasis provide the foundation for rational manipulation of barrier function and coagulation.

Abstract SARS-CoV-2 is continually evolving, with more contagious mutations spreading rapidly. Using in vitro evolution to affinity maturate the receptor-binding domain (RBD) of the spike protein towards ACE2 resulted in the more contagious mutations, S477N, E484K, and N501Y, to be among the first selected, explaining the convergent evolution of the “European” (20E-EU1), “British” (501.V1),”South African” (501.V2), and ‘‘Brazilian” variants (501.V3). Plotting the binding affinity to ACE2 of all RBD mutations against their incidence in the population shows a strong correlation between the two. Further in vitro evolution enhancing binding by 600-fold provides guidelines towards potentially new evolving mutations with even higher infectivity. For example, Q498R epistatic to N501Y. Nevertheless, the high-affinity RBD is also an efficient drug, inhibiting SARS-CoV-2 infection. The 2.9Å Cryo-EM structure of the high-affinity complex, including all rapidly spreading mutations, provides a structural basis for future drug and vaccine development and for in silico evaluation of known antibodies.