Maximum lifespan of a species is the oldest that individuals can survive, reflecting the genetic limit of longevity in an ideal environment. Here we report methylation-based models that accurately predict maximum lifespan (r=0.89), gestational time (r=0.96), and age at sexual maturity (r=0.87), using cytosine methylation patterns collected from over 12,000 samples derived from 192 mammalian species. Our epigenetic maximum lifespan predictor corroborated the extended lifespan in growth hormone receptor knockout mice and rapamycin treated mice. Across dog breeds, epigenetic maximum lifespan correlates positively with breed lifespan but negatively with breed size. Lifespan-related cytosines are located in transcriptional regulatory regions, such as bivalent chromatin promoters and polycomb-repressed regions, which were hypomethylated in long-lived species. The epigenetic estimators of maximum lifespan and other life history traits will be useful for characterizing understudied species and for identifying interventions that extend lifespan.

Summary Epigenetics has hitherto been studied and understood largely at the level of individual organisms. Here, we report a multi-faceted investigation of DNA methylation across 11,117 samples from 176 different species. We performed an unbiased clustering of individual cytosines into 55 modules and identified 31 modules related to primary traits including age, species lifespan, sex, adult species weight, tissue type and phylogenetic order. Analysis of the correlation between DNA methylation and species allowed us to construct phyloepigenetic trees for different tissues that parallel the phylogenetic tree. In addition, while some stable cytosines reflect phylogenetic signatures, others relate to age and lifespan, and in many cases responding to anti-aging interventions in mice such as caloric restriction and ablation of growth hormone receptors. Insights uncovered by this investigation have important implications for our understanding of the role of epigenetics in mammalian evolution, aging and lifespan.

ABSTRACT There is substantial evidence that age-related ovarian failure in rats is preceded by abnormal responsiveness of the neuroendocrine axis to estrogen positive feedback. In middle-aged (M-A) female rats, we have demonstrated that intrahypothalamic gene therapy for insulin-like growth factor-I (IGF-I) started at 6 months of age extends the regular cyclicity of the animals beyond 10 month (the age at which MA rats stop ovulating) and preserves the integrity of the ovarian structure. Here, we implemented long-term regenerative gene therapy in the hypothalamus of young females. The goal was to extend fertility in the treated animals. We constructed a helper-dependent adenovector that harbors the green fluorescent protein (GFP) reporter gene as well as a gene tandem, termed STEMCCA, which harbors the 4 Yamanaka genes (oct4, sox2, klf4, and c-myc, OSKM), both under the control of a Tet-Off bidirectional promoter. An adenovector that only carries the gene for GFP was used as control. At 4 months of age 12 female rats received an intrahypothalamic injection of our OSKM-GFP vector (treated rats); 12 control rats a vector expressing GFP only (control rats). At 9.3 months of age control and treated rats were mated with young males. A group of 12 young intact female rats was also mated. The rate of pregnancy recorded was 83%, 8.3% and 25% for young, M-A control and M-A treated animals, respectively. Average litter size was 9, 3 and 3 for the corresponding groups. Mean pup BW was slightly higher in the M-A rats. In a preliminary study we confirmed that ovulation in our M-A females ceases at 10 months of age. Our results are in line with the evidence that viral vector-mediated delivery of the Yamanaka genes in the brain has strong regenerative effects without adverse side effects. The particular significance of the present results is that, for the first time, they show that long-term OSKM gene therapy in the hypothalamus is able to extend the functionality of such a complex system as the hypothalamo-pituitary-ovarian axis.

ABSTRACT Young blood plasma is known to confer beneficial effects on various organs in mice and rats. However, it was not known whether plasma from young pigs rejuvenates old rat tissues at the epigenetic level; whether it alters the epigenetic clock, which is a highly accurate molecular biomarker of aging. To address this question, we developed and validated six different epigenetic clocks for rat tissues that are based on DNA methylation values derived from n=613 tissue samples. As indicated by their respective names, the rat pan-tissue clock can be applied to DNA methylation profiles from all rat tissues, while the rat brain-, liver-, and blood clocks apply to the corresponding tissue types. We also developed two epigenetic clocks that apply to both human and rat tissues by adding n=1366 human tissue samples to the training data. We employed these six rat clocks to investigate the rejuvenation effects of a porcine plasma fraction treatment in different rat tissues. The treatment more than halved the epigenetic ages of blood, heart, and liver tissue. A less pronounced, but statistically significant, rejuvenation effect could be observed in the hypothalamus. The treatment was accompanied by progressive improvement in the function of these organs as ascertained through numerous biochemical/physiological biomarkers and behavioral responses to assess cognitive functions. An immunoglobulin G (IgG) N-glycosylation pattern shift from pro-to anti-inflammatory also indicated reversal of glycan aging. Overall, this study demonstrates that a young porcine plasma-derived treatment markedly reverses aging in rats according to epigenetic clocks, IgG glycans, and other biomarkers of aging.

ABSTRACT Aging is often perceived as a degenerative process resulting from random accrual of cellular damage over time. Despite this, age can be accurately estimated by epigenetic clocks based on DNA methylation profiles from almost any tissue of the body. Since such pan-tissue epigenetic clocks have been successfully developed for several different species, we hypothesized that one can build pan-mammalian clocks that measure age in all mammalian species. To address this, we generated data using 11,754 methylation arrays, each profiling up to 36 thousand cytosines in highly-conserved stretches of DNA, from 59 tissue-types derived from 185 mammalian species. From these methylation profiles, we constructed three age predictors, each with a single mathematical formula, termed universal pan-mammalian clocks that are accurate in estimating the age (r>0.96) of any mammalian tissue. Deviations between epigenetic age and chronological age relate to mortality risk in humans, mutations that affect the somatotropic axis in mice, and caloric restriction. We characterized specific cytosines, whose methylation levels change with age across most mammalian species. These cytosines are greatly enriched in polycomb repressive complex 2-binding sites, are located in regions that gradually lose chromatin accessibility with age and are proximal to genes that play a role in mammalian development, cancer, human obesity, and human longevity. Collectively, these results support the notion that aging is indeed evolutionarily conserved and coupled to developmental processes across all mammalian species - a notion that was long-debated without the benefit of this new compelling evidence. SUMMARY This study identifies and characterizes evolutionarily conserved cytosines implicated in the aging process across mammals and establishes pan mammalian epigenetic clocks.

ABSTRACT In humans and rats, aging is associated with a progressive deterioration of spatial learning and memory. These functional alterations are correlated with morphological and molecular changes in the brain, particularly in the hippocampus. Here, we assessed the age-related changes in the DNA methylation (DNAm) landscape in the rat hippocampus and assessed the correlation of spatial memory performance with hippocampal DNAm age in young (2.6 mo.) and old (26.6 mo.) rats. Spatial memory performance was assessed with a modified version of the Barnes maze test. In order to evaluate learning ability as well as spatial memory retention, we assessed the time spent (permanence) by animals in goal sector 1 (GS 1 ) and 3 (GS 3 ) when the escape box was removed. The rat pan-tissue clock was applied to DNA methylation profiles of hippocampal tissue. The bisulfite converted genomic DNA was analyzed by Illumina Infinium HorvathMammalMethylChip40. The Horvath Mammal Methyl Chip40 assay provides quantitative measurements of DNA methylation for 22528 CpG dinucleotides that map to the Rattus norvegicus UCSC 6.0 genome. An enrichment pathway analysis revealed that neuron fate commitment, brain development, and central nervous system development were processes whose underlying genes were enriched in positively methylated CpGs. In the old rat hippocampi, the methylation levels of CpGs proximal to transcription factors associated with genes Pax5, Lbx1, Nr2f2, Hnf1b, Zic1, Zic4, Hoxd9; Hoxd10, Gli3, Gsx1 and Lmx1b, and Nipbl showed a significant regression with spatial memory performance. Regression analysis of different memory performance indices with hippocampal DNAm age was significant when data from young and old rats were taken together. The above results suggest that age-related hypermethylation of certain gene families, like Zic and Gli, may play a causal role in the decline in spatial memory in old rats. Hippocampal DNAm age seems to be a reliable index of spatial memory performance in young and old rats.

ABSTRACT Impaired performance in spatial learning and memory during aging in rats is associated with morphological and molecular changes in the brain, particularly in the hippocampus. Here, we assessed the cognitive performance of young (3.5 mo.) untreated rats and old (25.3 mo.) treated and control rats. Treatment was carried out by intrahippocampal injection of an adenovector that carries the GFP reporter gene as well as the 4 Yamanaka genes. Learning and spatial memory performance were assessed by means of the Barnes maze test. The learning performance of the OSKM-treated old rats was significantly improved compared to that of the control old counterparts. A marginal (P=0.06) improvement in the spatial memory was recorded in the treated versus control old rats. OSKM gene expression induced no pathological changes in the brain. The morphology and number of hippocampal cell populations like astrocytes and mature neurons did not show any changes with the treatment in the old rats as compared with the control old counterparts. The rat pan tissue DNAm age marker revealed that old OSKM gene-treated rats show a trend towards a decrease in epigenetic age. The Limma package was used to assess differential methylation by fitting linear models to the methylation data for specific group comparisons. Comparison of differential methylation between old treated and old control hippocampal DNA samples identified 671 differentially methylated CpGs probes (DPMs) in the DNA of OSKM-treated hippocampi (p<0.05). Assessment of the DPMs in old versus young controls revealed the presence of 1,279 hypomethylated CpGs near the promoter regions in young hippocampi (versus old controls) and 914 hypermethylated CpGs near the promoter in young hippocampi compared to old control hippocampi. We found a subset of 174 hypomethylated CpGs in the hippocampal DNA from old OSKM rats and young controls both compared with old control hippocampi. This means that in the hippocampal DNA there is a common set of CpGs which are hypermethylated during aging and are demethylated by the OSKM genes. This observation suggested that in these 174 CpGs the hypermethylation induced by aging is reversed by the demethylation effect of the OSKM genes on the same 174 CpGs. This observation can be interpreted as a rejuvenation effect of the OSKM genes of the old hippocampal methylome. Our results extend to the rat the evidence that viral vector-mediated delivery of the Yamanaka genes in the brain has strong regenerative effects without adverse side effects.