Maximum lifespan of a species is the oldest that individuals can survive, reflecting the genetic limit of longevity in an ideal environment. Here we report methylation-based models that accurately predict maximum lifespan (r=0.89), gestational time (r=0.96), and age at sexual maturity (r=0.87), using cytosine methylation patterns collected from over 12,000 samples derived from 192 mammalian species. Our epigenetic maximum lifespan predictor corroborated the extended lifespan in growth hormone receptor knockout mice and rapamycin treated mice. Across dog breeds, epigenetic maximum lifespan correlates positively with breed lifespan but negatively with breed size. Lifespan-related cytosines are located in transcriptional regulatory regions, such as bivalent chromatin promoters and polycomb-repressed regions, which were hypomethylated in long-lived species. The epigenetic estimators of maximum lifespan and other life history traits will be useful for characterizing understudied species and for identifying interventions that extend lifespan.

Summary Epigenetics has hitherto been studied and understood largely at the level of individual organisms. Here, we report a multi-faceted investigation of DNA methylation across 11,117 samples from 176 different species. We performed an unbiased clustering of individual cytosines into 55 modules and identified 31 modules related to primary traits including age, species lifespan, sex, adult species weight, tissue type and phylogenetic order. Analysis of the correlation between DNA methylation and species allowed us to construct phyloepigenetic trees for different tissues that parallel the phylogenetic tree. In addition, while some stable cytosines reflect phylogenetic signatures, others relate to age and lifespan, and in many cases responding to anti-aging interventions in mice such as caloric restriction and ablation of growth hormone receptors. Insights uncovered by this investigation have important implications for our understanding of the role of epigenetics in mammalian evolution, aging and lifespan.

ABSTRACT Age-related changes to cytosine methylation have been extensively characterized across the mammalian family. Some cytosines that are conserved across mammals exhibit age-related methylation changes that are so consistent that they were used to successfully develop cross-species age predictors. In a similar vein, methylation levels of some conserved cytosines correlate highly with species lifespan, leading to the development of highly accurate lifespan predictors. Surprisingly, little to no commonality is found between these two sets of cytosines even though the relationship between aging and lifespan is by most measures linked. We ventured to address this conundrum by first identifying age-related cytosines whose methylation levels change in opposite directions between short and long-lived species. We hypothesized that age-related CpGs that are also associated with species lifespan would tap into biological processes that simultaneously impact aging and lifespan. To this end, we analyzed age-related cytosine methylation patterns in 82 mammalian species. For each CpG, we correlated the intra-species age correlation with maximum lifespan across mammalian species. We refer to this correlation of correlations as Lifespan Uber Correlation (LUC) . This approach is unique in incorporating age and species lifespan in a single analysis. We identified 629 CpGs with opposing methylation aging patterns in long and short-lived species. Many of these are found to be near BCL11B , NPTN, and HOXC4 loci. Methylation and transcription analyses of Bcl11b knockout mice indicate that this gene partially regulates the methylation state of LUC CpGs. We developed DNAm age estimators (epigenetic clocks) based on LUC CpGs. These LUC clocks exhibited the expected behavior in benchmark aging interventions such as caloric restriction, growth hormone receptor knockout and high-fat diet. Furthermore, we found that Bcl11b heterozygous knockout mice exhibited an increased epigenetic age in the striatum. Overall, we present a bioinformatics approach that identified CpGs and their associated genes implicated both in aging and lifespan. These cytosines lend themselves to developing epigenetic clocks that are sensitive to perturbations that impact both age and lifespan.

Summary Diet and environment profoundly modulate lifespan. We measured longevity as a function of diet and weight gain across a genetically diverse family of mice. We followed 1348 females from two parental strains—C57BL/6J and DBA/2J—and 146 cohorts of BXD isogenic progeny strains ( n = 73) across their lifespan on a low fat chow diet (CD, 18% calories from fat) and on a high fat diet (HFD, 60% calories from fat). On average, HFD shortens lifespan by 85 days or 12%, roughly equivalent to an 8–10 year decrease in humans. However, strain variation in the response of diet on longevity is remarkably high, ranging from a longevity loss of 54% in BXD65 to a gain of 37% in BXD8. Baseline weights and early weight gain are both associated with a mean decrease in longevity of ∼4 days/g. By 500 days-of-age, cases fed HFD gained four times as much weight as control on average. However, strain-specific variation was substantial, thus weight gain did not correlate well with lifespan. In summary, high fat had a strong negative effect on longevity, but genetic interactions effects were even stronger. This highlights the unequivocal importance of genetic differences in making dietary recommendations.

Abstract Changes in DNA methylation (DNAm) are linked to aging. Here, we profile highly conserved CpGs in 339 predominantly female mice belonging to the BXD family for which we have deep longevity and genomic data. We use a ‘pan-mammalian’ microarray that provides a common platform for assaying the methylome across mammalian clades. We computed epigenetic clocks and tested associations with DNAm entropy, diet, weight, metabolic traits, and genetic variation. We describe the multifactorial variance of methylation at these CpGs, and show that high fat diet augments the age-associated changes. Entropy increases with age. The progression to disorder, particularly at CpGs that gain methylation over time, was predictive of genotype-dependent life expectancy. The longer-lived BXD strains had comparatively lower entropy at a given age. We identified two genetic loci that modulate rates of epigenetic age acceleration (EAA): one on chromosome (Chr) 11 that encompasses the Erbb2/Her2 oncogenic region, and a second on Chr19 that contains a cytochrome P450 cluster. Both loci harbor genes associated with EAA in humans including STXBP4 , NKX2- 3, and CUTC . Transcriptome and proteome analyses revealed associations with oxidation-reduction, metabolic, and immune response pathways. Our results highlight concordant loci for EAA in humans and mice, and demonstrate a tight coupling between the metabolic state and epigenetic aging.

Abstract Obesity is associated with chronic multi-system bioenergetic stress that may be improved by increasing the number of healthy mitochondria available across organ systems. However, treatments capable of increasing mitochondrial content are generally limited to endurance exercise training paradigms, which are not always sustainable long-term, let alone feasible for many patients with obesity. Recent studies have shown that local transfer of exogenous mitochondria from healthy donor tissues can improve bioenergetic outcomes and alleviate the effects of tissue injury in recipients with organ specific disease. Thus, the aim of this project was to determine the feasibility of systemic mitochondrial transfer for improving energy balance regulation in the setting of diet-induced obesity. We found that transplantation of mitochondria from lean mice into mice with diet-induced obesity attenuated adiposity gains by increasing energy expenditure and promoting the mobilization and oxidation of lipids. Additionally, mice that received exogenous mitochondria demonstrated improved glucose uptake, greater insulin responsiveness, and complete reversal of hepatic steatosis. These changes were, in part, driven by adaptations occurring in white adipose tissue. Together, these findings are proof-of-principle that mitochondrial transplantation is an effective therapeutic strategy for limiting the deleterious metabolic effects of diet-induced obesity in mice.

ABSTRACT Aging is often perceived as a degenerative process resulting from random accrual of cellular damage over time. Despite this, age can be accurately estimated by epigenetic clocks based on DNA methylation profiles from almost any tissue of the body. Since such pan-tissue epigenetic clocks have been successfully developed for several different species, we hypothesized that one can build pan-mammalian clocks that measure age in all mammalian species. To address this, we generated data using 11,754 methylation arrays, each profiling up to 36 thousand cytosines in highly-conserved stretches of DNA, from 59 tissue-types derived from 185 mammalian species. From these methylation profiles, we constructed three age predictors, each with a single mathematical formula, termed universal pan-mammalian clocks that are accurate in estimating the age (r>0.96) of any mammalian tissue. Deviations between epigenetic age and chronological age relate to mortality risk in humans, mutations that affect the somatotropic axis in mice, and caloric restriction. We characterized specific cytosines, whose methylation levels change with age across most mammalian species. These cytosines are greatly enriched in polycomb repressive complex 2-binding sites, are located in regions that gradually lose chromatin accessibility with age and are proximal to genes that play a role in mammalian development, cancer, human obesity, and human longevity. Collectively, these results support the notion that aging is indeed evolutionarily conserved and coupled to developmental processes across all mammalian species - a notion that was long-debated without the benefit of this new compelling evidence. SUMMARY This study identifies and characterizes evolutionarily conserved cytosines implicated in the aging process across mammals and establishes pan mammalian epigenetic clocks.

The Illumina Infinium MethylationEPIC provides an efficient platform for profiling DNA methylation in humans at over 850,000 CpGs. Model organisms such as mice do not currently benefit from an equivalent array. Here we used this array to measure DNA methylation in mice. We defined probes targeting conserved regions and performed a comparison between the array-based assay and affinity-based DNA sequencing of methyl-CpGs (MBD-seq). Mouse samples consisted of 11 liver DNA from two strains, C57BL/6J (B6) and DBA/2J (D2), that varied widely in age. Linear regression was applied to detect differential methylation. In total, 13,665 probes (1.6% of total probes) aligned to conserved CpGs. Beta-values (β-value) for these probes showed a distribution similar to that in humans. Overall, there was high concordance in methylation signal between the EPIC array and MBD-seq (Pearson correlation r = 0.70, p-value < 0.0001). However, the EPIC probes had higher quantitative sensitivity at CpGs that are hypo- (β-value < 0.3) or hypermethylated (β-value > 0.7). In terms of differential methylation, no EPIC probe detected significant difference between age groups at a Benjamini-Hochberg threshold of 10%, and the MBD-seq performed better at detecting age-dependent change in methylation. However, the top most significant probe for age (cg13269407; uncorrected p-value = 1.8 x 10-5) is part of the clock CpGs used to estimate the human epigenetic age. For strain, 219 Infinium probes detected significant differential methylation (FDR cutoff 10%) with ~80% CpGs associated with higher methylation in D2. This higher methylation profile in D2 compared to B6 was also replicated by the MBD-seq data. To summarize, we found only a small subset of EPIC probes that target conserved sites. However, for this small subset the array provides a reliable assay of DNA methylation and can be effectively used to measure differential methylation in mice.

DNA methylation (DNAm) is shaped by genetic and environmental factors and modulated by aging. Here, we examine interrelations between epigenetic aging, body weight (BW), and lifespan in 12 inbred mouse strains from the BXD panel that exhibit over two-fold variation in longevity. Genome-wide DNAm was assayed in 70 liver specimens from mice ranging in age from 6 to 25 months that were maintained on normal chow or high fat diet (HFD). We defined subsets of CpG regions associated with age, BW at young adulthood, and strain-by-diet dependent life expectancy. The age associated differentially methylated CpG regions (age-DMRs) featured distinct genomic characteristics, with DNAm gains over time occurring in sites with high CpG density and low average methylation. CpG regions associated with BW were enriched in introns and generally showed lower methylation in mice with higher BW, and inversely correlated with gene expression such that mRNA was higher in mice with higher BW. Lifespan-associated regions featured no distinct genomic characteristics but were linked to genes involved in lifespan regulation, including the telomerase reverse transcriptase gene, Tert , which showed lower methylation and higher gene expression in long-lived strains. An epigenetic clock defined from the age-DMRs conveyed accelerated aging in mice belonging to strains with shorter lifespans. Both higher BW at young adulthood and HFD were associated with accelerated epigenetic aging. Our results highlight the age-accelerating effect of heavier body weight. Furthermore, the study demonstrates that the measure of epigenetic aging derived from age-DMRs can predict strain and diet-induced differences in lifespan.

Aging can be associated with the accumulation of hypobranched glycogen molecules (polyglucosan bodies, PGBs), particularly in astrocytes of the hippocampus. While PGBs have a detrimental effect on cognition in diseases such as adult polyglucosan body disease and Lafora disease, the underlying mechanism and clinical relevance of age-related PGB accumulation remains unknown. Here, we have investigated the genetic basis and functional impact of age-related PGB accumulation in 32 fully sequenced BXD-type strains of mice which exhibit a 400-fold variation in PGB burden in 16-18 month old females. We mapped a major locus controlling PGB density in the hippocampus to chromosome 1 at 72-75 Mb (linkage of 4.9 -logP), which we defined as the Pgb1 locus. To identify potentially causal gene variants within Pgb1, we generated extensive hippocampal transcriptome datasets and identified two strong candidate genes for which mRNA correlates with PGB density, Smarcal1 and Usp37. In addition, both Smarcal1 and Usp37 contain non-synonymous allele variations likely to impact protein function. A phenome-wide association analysis highlighted a trans-regulatory effect of the Pgb1 locus on expression of Hp1bp3, a gene known to play a role in age-related changes in learning and memory. To investigate the potential impact of PGBs on cognition, we performed conditioned fear memory testing on strains displaying varying degrees of PGB burden, and a phenome-wide association scan of ~12,000 behavioral traits. Importantly, we did not find any evidence suggesting a negative impact of PGB burden on cognitive capacity. Taken together, we have identified a major modifier locus controlling PGB burden in the hippocampus and shed light on the genetic architecture and clinical relevance of this strikingly heterogeneous hippocampal phenotype.