Abstract Single-cell technologies have transformed our understanding of human tissues. Yet, studies typically capture only a limited number of donors and disagree on cell type definitions. Integrating many single-cell datasets can address these limitations of individual studies and capture the variability present in the population. Here we present the integrated Human Lung Cell Atlas (HLCA), combining 49 datasets of the human respiratory system into a single atlas spanning over 2.4 million cells from 486 individuals. The HLCA presents a consensus cell type re-annotation with matching marker genes, including annotations of rare and previously undescribed cell types. Leveraging the number and diversity of individuals in the HLCA, we identify gene modules that are associated with demographic covariates such as age, sex and body mass index, as well as gene modules changing expression along the proximal-to-distal axis of the bronchial tree. Mapping new data to the HLCA enables rapid data annotation and interpretation. Using the HLCA as a reference for the study of disease, we identify shared cell states across multiple lung diseases, including SPP1 + profibrotic monocyte-derived macrophages in COVID-19, pulmonary fibrosis and lung carcinoma. Overall, the HLCA serves as an example for the development and use of large-scale, cross-dataset organ atlases within the Human Cell Atlas.

Abstract Fibroblast to myofibroblast conversion is a major driver of tissue remodeling in organ fibrosis. Several distinct lineages of fibroblasts support homeostatic tissue niche functions, yet, specific activation states and phenotypic trajectories of fibroblasts during injury and repair have remained unclear. Here, we combined spatial transcriptomics, longitudinal single-cell RNA-seq and genetic lineage tracing to study fibroblast fates during mouse lung regeneration. We discovered a transitional fibroblast state characterized by high Sfrp1 expression, derived from both Tcf21-Cre lineage positive and negative cells. Sfrp1+ cells appeared early after injury in peribronchiolar, adventitial and alveolar locations and preceded the emergence of myofibroblasts. We identified lineage specific paracrine signals and inferred converging transcriptional trajectories towards Sfrp1+ transitional fibroblasts and Cthrc1+ myofibroblasts. Tgfβ1 downregulated Sfrp1 in non-invasive transitional cells and induced their switch to an invasive Cthrc1+ myofibroblast identity. Finally, using loss of function studies we showed that autocrine Sfrp1 directly inhibits fibroblast invasion by regulating the RhoA pathway. In summary, our study reveals the convergence of spatially and transcriptionally distinct fibroblast lineages into transcriptionally uniform myofibroblasts and identifies Sfrp1 as an autocrine inhibitor of fibroblast invasion during early stages of fibrogenesis.

Aging promotes lung function decline and susceptibility to chronic lung diseases, which are the third leading cause of death worldwide. We used single cell transcriptomics and mass spectrometry to quantify changes in cellular activity states of 30 cell types and the tissue proteome from lungs of young and old mice. Aging led to increased transcriptional noise, indicating deregulated epigenetic control. We observed highly distinct effects of aging on cell type level, uncovering increased cholesterol biosynthesis in type-2 pneumocytes and lipofibroblasts as a novel hallmark of lung aging. Proteomic profiling revealed extracellular matrix remodeling in old mice, including increased collagen IV and XVI and decreased Fraser syndrome complex proteins and Collagen XIV. Computational integration of the aging proteome and single cell transcriptomes predicted the cellular source of regulated proteins and created a first unbiased reference of the aging lung. The lung aging atlas can be accessed via an interactive user-friendly webtool at: https://theislab.github.io/LungAgingAtlas

Abstract Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a lethal and chronic lung disease characterized by aberrant intercellular communication, increased extracellular matrix (ECM) deposition, and destruction of functional lung tissue. Extracellular vesicles (EVs) accumulate within the lung in IPF, but their cargo and biological effects remain unclear. Here, we provide the entire the proteome of EV and non-EV fraction during pulmonary fibrosis, and functionally characterize their contribution to fibrosis. EVs were isolated by differential ultracentrifugation of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) collected from mice challenged with bleomycin (or PBS as control) or culture supernatants from primary mouse lung fibroblasts. EVs were characterized by nanoparticle tracking analysis, Western Blotting, and quantitative mass spectrometry to define their proteome. EVs accumulation peaked at 14 days post-bleomycin instillation and correlated with decreased lung function. Label-free proteomics identified 107 proteins specific to fibrotic BALF-EVs. This signature was associated with wound healing, extracellular matrix organization, and cell motility. BALF-EVs from fibrotic lungs promoted fibrogenesis, including induction of ECM proteins in precision cut lung slices ex vivo and impaired alveolar epithelial cell stem cell function. Deconvolution using single cell RNA sequencing datasets revealed that fibroblasts are the major cellular source of BALF-EVs. EVs from fibroblasts were significantly enriched in Secreted Frizzled Related Protein 1 (SFRP1). In the lungs of patients with IPF, SFRP1 was significantly increased in mesenchymal cells. Sfrp1 deficiency reduced the ability of fibroblast-derived EVs to potentiate bleomycin-induced lung fibrosis in vivo and led to a reduction in fibrosis marker gene expression. In sum, EVs carry specific protein cargos, such as SFRP1, to contribute to organ remodeling during fibrosis. Our data identified EVs transporting SFRP1 as a potential therapeutic target for IPF.

Abstract Spatial transcriptomics (ST) provides a unique opportunity to study cellular organization and cell-cell interactions at the molecular level. However, due to the low resolution of the sequencing data additional information is required to utilize this technology, especially for cases where only a few cells are present for important cell types. To enable the use of ST to study senescence we developed scDOT, which combines ST and single cell RNA-Sequencing (scRNA-Seq) to improve the ability to reconstruct single cell resolved spatial maps. scDOT integrates optimal transport and expression deconvolution to learn non-linear couplings between cells and spots and to infer cell placements. Application of scDOT to existing and new lung ST data improves on prior methods and allows the identification of the spatial organization of senescent cells, the identification of their neighboring cells and the identification of novel genes involved in cell-cell interactions that may be driving senescence.

ABSTRACT Organ- and body-scale cell atlases have the potential to transform our understanding of human biology. To capture the variability present in the population, these atlases must include diverse demographics such as age and ethnicity from both healthy and diseased individuals. The growth in both size and number of single-cell datasets, combined with recent advances in computational techniques, for the first time makes it possible to generate such comprehensive large-scale atlases through integration of multiple datasets. Here, we present the integrated Human Lung Cell Atlas (HLCA) combining 46 datasets of the human respiratory system into a single atlas spanning over 2.2 million cells from 444 individuals across health and disease. The HLCA contains a consensus re-annotation of published and newly generated datasets, resolving under- or misannotation of 59% of cells in the original datasets. The HLCA enables recovery of rare cell types, provides consensus marker genes for each cell type, and uncovers gene modules associated with demographic covariates and anatomical location within the respiratory system. To facilitate the use of the HLCA as a reference for single-cell lung research and allow rapid analysis of new data, we provide an interactive web portal to project datasets onto the HLCA. Finally, we demonstrate the value of the HLCA reference for interpreting disease-associated changes. Thus, the HLCA outlines a roadmap for the development and use of organ-scale cell atlases within the Human Cell Atlas.

Nanomedicines hold immense promise for a number of devastating diseases due to the ability to custom-design both the carrier and cargo. However, their clinical implementation has been hampered by physicochemical and biological barriers and off-target deposition which impair cell specific targeting, especially in internal organs. This study reports a new delivery approach using organ-restricted vascular delivery to allow for direct administration and recirculation of stimuli-responsive nanoparticles to promote cellular uptake into an organ of interest. Using this technique, nanoparticles reach the interior of dense tumors and are selectively taken up by lung cancer cells. Importantly, this surgical approach is essential as the same nanoparticles do not reach lung tumor cells upon systemic or intratracheal administration. Organ-restricted vascular delivery thus opens up new avenues for optimized nanotherapies for cancer and other diseases.

SUMMARY A detailed understanding of intestinal stem cell (ISC) self-renewal and differentiation is required to better treat chronic intestinal diseases. However, different models of ISC lineage hierarchy 1–6 and segregation 7–12 are debated. Here we report the identification of Lgr5 + ISCs that express Flattop ( Fltp ), a Wnt/planar cell polarity (PCP) reporter and effector gene. Lineage labelling revealed that Wnt/PCP-activated Fltp + ISCs are primed either towards the enteroendocrine or the Paneth cell lineage in vivo . Integration of time-resolved lineage labelling with genome-wide and targeted single-cell gene expression analysis allowed us to delineate the ISC differentiation path into enteroendocrine and Paneth cells at the molecular level. Strikingly, we found that both lineages are directly recruited from ISCs via unipotent transition states, challenging the existence of formerly predicted bi- or multipotent secretory progenitors 7–12 . Transitory cells that mature into Paneth cells are quiescent and express both stem cell and secretory lineage genes, indicating that these cells are the previously described Lgr5 + labelretaining cells 7 . Wnt/PCP-activated Lgr5 + ISCs are indistinguishable from Wnt/β-catenin-activated Lgr5 + ISCs based on the expression of stem-cell signature or secretory lineagespecifying genes but possess less self-renewal activity. This suggests that lineage priming and cell-cycle exit is triggered at the post-transcriptional level by polarity cues and a switch from canonical to non-canonical Wnt/PCP signalling. Taken together, we identified the Wnt/PCP pathway as a new niche signal and polarity cue regulating stem cell fate. Active Wnt/PCP signalling represents one of the earliest events in ISC lineage priming towards the Paneth and enteroendocrine cell fate, preceding lateral inhibition and expression of secretory lineagespecifying genes. Thus, our findings provide a better understanding of the niche signals and redefine the mechanisms underlying ISC lineage hierarchy and segregation.

Abstract Bronchiolitis obliterans syndrome (BOS) due to chronic rejection is the main reason for poor outcomes after lung transplantation (LTx). We and others have recently identified B cells as major contributors to BOS after LTx. The extent of B cell heterogeneity, however, as well as those B cell populations that determine chronic rejection of the lung, remain entirely unclear. Here, we provide a map of cell population heterogeneity and their gene expression patterns during chronic rejection after orthotopic LTx in mice. Out of a total of 14 major comprehensive cell clusters, corresponding to 11 known major cell subpopulations, Mzb1 -expressing plasma cells (PCs) were the most prominently increased cell population in lungs with BOS. Scgb1a1 -expressing bronchial epithelial cells were depleted, while Cd14 -expressing monocytes and Pdgfra -expressing fibroblasts were enriched in BOS grafts. These findings were validated in two different cohorts of human BOS after LTx. MZB1-IgG-double positive PCs infiltrated the airways of patients with BOS, while they were absent from healthy lungs. IgG, but not IgA, IgD, IgE or IgM, were significantly increased in bronchoalveolar lavage from BOS patients, compared with LTx patients who did not develop BOS. Pseudotime and trajectory analysis revealed that a Bhlhe41 , Cxcr3, Itgb1 -triple positive-B cell subset, also expressing classical markers of the innate-like B-1 B cell population, served as the progenitor pool for Mzb1 + PCs. This progenitor B cell subset accounted for the increase in IgG 2c expression and production in BOS lung grafts. Importantly, Aicda −/− mice, which lack all isotypes of Ig (except IgM) were protected from the onset of BOS after LTx. In summary, we provide a detailed atlas of cell population changes of chronic rejection after LTx. We have identified IgG-positive PCs and their progenitors – an innate B cell subpopulation characterized by a specific subset of markers - as the major source of local antibody production and a major contributor to both mouse and human BOS after LTx.

Cells respond to a myriad of stressors by senescing, acquiring stable growth arrest, morphologic and metabolic changes, and a senescence-associated-secretory-phenotype (SASP). The heterogeneity of senescent cells (SnCs) and their SASP is vast, yet poorly characterized. SnCs have diverse roles in health and disease and are therapeutically targetable, making characterization of SnCs and harmonization of their nomenclature a priority. The Cellular Senescence Network (SenNet), a NIH Common Fund initiative, will leverage emerging single cell and spatial-omics to identify and map SnCs in numerous organs across the lifespan of humans and mice. A common coordinate framework will integrate the data, using validated, standardized methods, creating public 4-dimensional SnC atlases. Key SenNet deliverables include development of innovative tools/technologies to detect SnCs, biomarker discovery, common annotations to describe SnCs and extensive public data sets. The goal is to comprehensively understand and map SnCs for diagnostic and therapeutic purposes to improve human health.