We have developed a high-resolution fluorescence microscopy method based on high-accuracy localization of photoswitchable fluorophores. In each imaging cycle, only a fraction of the fluorophores were turned on, allowing their positions to be determined with nanometer accuracy. The fluorophore positions obtained from a series of imaging cycles were used to reconstruct the overall image. We demonstrated an imaging resolution of 20 nm. This technique can, in principle, reach molecular-scale resolution.

Recent advances in far-field fluorescence microscopy have led to substantial improvements in image resolution, achieving a near-molecular resolution of 20 to 30 nanometers in the two lateral dimensions. Three-dimensional (3D) nanoscale-resolution imaging, however, remains a challenge. We demonstrated 3D stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) by using optical astigmatism to determine both axial and lateral positions of individual fluorophores with nanometer accuracy. Iterative, stochastic activation of photoswitchable probes enables high-precision 3D localization of each probe, and thus the construction of a 3D image, without scanning the sample. Using this approach, we achieved an image resolution of 20 to 30 nanometers in the lateral dimensions and 50 to 60 nanometers in the axial dimension. This development allowed us to resolve the 3D morphology of nanoscopic cellular structures.

Multiplexed RNA imaging in single cells The basis of cellular function is where and when proteins are expressed and in what quantities. Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments quantify the copy number and location of mRNA molecules; however, the numbers of RNA species that can be simultaneously measured by smFISH has been limited. Using combinatorial labeling with error-robust encoding schemes, Chen et al. simultaneously imaged 100 to 1000 RNA species in a single cell. Such large-scale detection allows regulatory interactions to be analyzed at the transcriptome scale. Science , this issue p. 10.1126/science.aaa6090

Recent advances in far-field optical nanoscopy have enabled fluorescence imaging with a spatial resolution of 20 to 50 nanometers. Multicolor super-resolution imaging, however, remains a challenging task. Here, we introduce a family of photo-switchable fluorescent probes and demonstrate multicolor stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Each probe consists of a photo-switchable “reporter” fluorophore that can be cycled between fluorescent and dark states, and an “activator” that facilitates photo-activation of the reporter. Combinatorial pairing of reporters and activators allows the creation of probes with many distinct colors. Iterative, color-specific activation of sparse subsets of these probes allows their localization with nanometer accuracy, enabling the construction of a super-resolution STORM image. Using this approach, we demonstrate multicolor imaging of DNA model samples and mammalian cells with 20- to 30-nanometer resolution. This technique will facilitate direct visualization of molecular interactions at the nanometer scale.

A quantitative characterization of the switching properties of 26 organic dyes relates these properties to the quality of localization-based super-resolution images they generate. The data are a useful resource for selecting dyes and point to avenues for future analysis. One approach to super-resolution fluorescence imaging uses sequential activation and localization of individual fluorophores to achieve high spatial resolution. Essential to this technique is the choice of fluorescent probes; the properties of the probes, including photons per switching event, on-off duty cycle, photostability and number of switching cycles, largely dictate the quality of super-resolution images. Although many probes have been reported, a systematic characterization of the properties of these probes and their impact on super-resolution image quality has been described in only a few cases. Here we quantitatively characterized the switching properties of 26 organic dyes and directly related these properties to the quality of super-resolution images. This analysis provides guidelines for characterization of super-resolution probes and a resource for selecting probes based on performance. Our evaluation identified several photoswitchable dyes with good to excellent performance in four independent spectral ranges, with which we demonstrated low–cross-talk, four-color super-resolution imaging.

We report direct, real-time electrical detection of single virus particles with high selectivity by using nanowire field effect transistors. Measurements made with nanowire arrays modified with antibodies for influenza A showed discrete conductance changes characteristic of binding and unbinding in the presence of influenza A but not paramyxovirus or adenovirus. Simultaneous electrical and optical measurements using fluorescently labeled influenza A were used to demonstrate conclusively that the conductance changes correspond to binding/unbinding of single viruses at the surface of nanowire devices. pH-dependent studies further show that the detection mechanism is caused by a field effect, and that the nanowire devices can be used to determine rapidly isoelectric points and variations in receptor-virus binding kinetics for different conditions. Lastly, studies of nanowire devices modified with antibodies specific for either influenza or adenovirus show that multiple viruses can be selectively detected in parallel. The possibility of large-scale integration of these nanowire devices suggests potential for simultaneous detection of a large number of distinct viral threats at the single virus level.

Axonal Actin How actin is organized in the axons and dendrites of neurons is largely unknown. Xu et al. (p. 452 , published online 13 December) imaged actin in axons and dendrites using stochastic optical reconstruction microscopy. Surprisingly, while actin in dendrites formed long filaments, the actin in axons was organized into evenly spaced ringlike structures at the axon circumference. Spectrin, which is known to interact with actin to form a membrane cytoskeleton in erythrocytes, formed periodic structures that alternated with those of actin. This actin-spectrin cytoskeletal structure might give mechanical support to axons and could also organize other membrane proteins.

Anyone who has used a light microscope has wished that its resolution could be a little better. Now, after centuries of gradual improvements, fluorescence microscopy has made a quantum leap in its resolving power due, in large part, to advancements over the past several years in a new area of research called super-resolution fluorescence microscopy. In this Primer, we explain the principles of various super-resolution approaches, such as STED, (S)SIM, and STORM/(F)PALM. Then, we describe recent applications of super-resolution microscopy in cells, which demonstrate how these approaches are beginning to provide new insights into cell biology, microbiology, and neurobiology. Anyone who has used a light microscope has wished that its resolution could be a little better. Now, after centuries of gradual improvements, fluorescence microscopy has made a quantum leap in its resolving power due, in large part, to advancements over the past several years in a new area of research called super-resolution fluorescence microscopy. In this Primer, we explain the principles of various super-resolution approaches, such as STED, (S)SIM, and STORM/(F)PALM. Then, we describe recent applications of super-resolution microscopy in cells, which demonstrate how these approaches are beginning to provide new insights into cell biology, microbiology, and neurobiology. For centuries, light microscopy has greatly facilitated our understanding of how cells function. In fact, entire fields of biology have emerged from images acquired under light microscopes. For instance, more than 300 hundred years ago, Antonie van Leeuwenhoek used his self-ground optical lenses to discover bacteria and commence the field of microbiology. Then, ∼200 years later, Ramón y Cajal used light microscopes to visualize Golgi-stained brain sections and create beautiful drawings of neurons, which led to his ingenious vision of how information flows in the nervous systems and helped to form modern neurobiology. Indeed, one major element that makes light microscopy so powerful in biological research is the development of various staining methods that permit the labeling of specific molecules and cells. For example, fluorescence in situ hybridization (FISH) detects DNA and RNA molecules with specific sequences, whereas immunofluorescence labels and fluorescent proteins allow the imaging of particular proteins in cells (Giepmans et al., 2006Giepmans B.N. Adams S.R. Ellisman M.H. Tsien R.Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.Science. 2006; 312: 217-224Crossref PubMed Scopus (2198) Google Scholar). Even single molecules within a living cell can be visualized when these labeling strategies are combined with highly sensitive optical schemes and detectors (Lord et al., 2010Lord S.J. Lee H.L. Moerner W.E. Single-molecule spectroscopy and imaging of biomolecules in living cells.Anal. Chem. 2010; 82: 2192-2203Crossref PubMed Scopus (120) Google Scholar, Xie et al., 2008Xie X.S. Choi P.J. Li G.W. Lee N.K. Lia G. Single-molecule approach to molecular biology in living bacterial cells.Annu. Rev. Biophys. 2008; 37: 417-444Crossref PubMed Scopus (270) Google Scholar). The unrivaled combination of molecule-specific contrast and live-cell imaging capability makes fluorescence microscopy the most popular imaging modality in cell biology. Browse through any cell biological journal, and the impact of fluorescent microscopy is obvious, with > 80% of the images of cells in the book usually acquired with a fluorescent microscope. However, the application of fluorescence microscopy to many areas of biology is still hindered by its moderate resolution of several hundred nanometers. This resolution is approximately the size of an intracellular organelle and thus is inadequate for dissecting the inner architecture of many subcellular structures. The resolution for optical microscopy is limited by the diffraction, or the “spreading out,” of the light wave when it passes through a small aperture or is focused to a tiny spot. Because this property is intrinsic to all waves, breaking the diffraction barrier of light microscopy has been deemed impossible for a long time. However, such limitations have not deterred a small group of scientists from pursuing “super-resolution” fluorescence microscopy that breaks through this seemingly impenetrable barrier. The risk has paid off abundantly. Recently, these research teams have developed several optical microscopy techniques that have shattered the diffraction barrier, improving spatial resolution by an order of magnitude or more over the diffraction limit. Most importantly, these techniques are beginning to provide insights into biological processes at the cellular and molecular scale that were hitherto unattainable. In this Primer, we review the technological advances in the burgeoning field of “super-resolution fluorescence microscopy.” Then, we describe the application of these techniques to various areas of biology, which have quickly demonstrated the great promise of this exciting new area of bioimaging. When light is focused by the objective of a microscope, the notion of light “rays” converging to an infinitely sharp “focal point” does not happen. Instead, the light wave forms a blurry focal spot with a finite size due to diffraction (Figure 1A ). The size of the spot depends on the wavelength of the light and the angle at which the light wave converges; the latter is, in turn, determined by the numerical aperture of the objective. The width of the spot is ∼0.6 λ/NA, wherein λ is the wavelength of the light and NA is the numerical aperture of the lens. Similarly, a point emitter, such as a single fluorescent molecule, also appears as a blurry spot with a finite size when imaged through a microscope. The intensity profile of this spot, which defines the point spread function (PSF) of the microscope, has approximately the same width as that of the focal spot described above. Consequently, two identical emitters separated by a distance less than the width of the PSF will appear as a single object, making them unresolvable from each other (Figure 1A). This resolution limit was originally recognized by Ernst Abbe ∼150 years ago, and thus, it is also called the Abbe limit (Abbe, 1873Abbe E. Beitrage zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung.Arch. Mikroskop Anat. 1873; 9: 413-420Crossref Scopus (1590) Google Scholar). The diffraction-limited image resolution of objective lens with a high numerical aperture is ∼250 nm perpendicular to the direction of light propagation (i.e., in the lateral dimensions) and ∼550 nm parallel to the direction of light propagation (i.e., in the axial dimension) (Figure 1A). Many subcellular structures are smaller than these resolution limits, and therefore, they are unresolvable by light microscopes (Figure 1B). For many years, several imaging techniques have pushed the boundary of the diffraction limit of light microscopy. Among these methods, confocal microscopy and multiphoton fluorescence microscopy not only enhance the image resolution, but also reduce the out-of-focus fluorescence background, allowing optical sectioning and thus three-dimensional imaging. In addition, infrared light experiences a lower amount of scattering from tissues, allowing deep tissue imaging with two-photon microscopy (Zipfel et al., 2003Zipfel W.R. Williams R.M. Webb W.W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.Nat. Biotechnol. 2003; 21: 1369-1377Crossref PubMed Scopus (2905) Google Scholar). 4Pi microscopy and I5M use two opposing objective lenses to increase the effective numerical aperture of the microscope and thereby improve the image resolution (Gustafsson et al., 1995Gustafsson M.G.L. Agard D.A. Sedat J.W. Sevenfold improvement of axial resolution in 3D wide-field microscopy using two objective lenses.Proc. SPIE. 1995; 2412: 147-156Crossref Google Scholar, Hell and Stelzer, 1992Hell S.W. Stelzer E.H.K. Fundamental improvement of resolution with 4Pi-confocal fluorescence microscope using 2-photon excitation.Opt. Commun. 1992; 93: 277-282Crossref Scopus (354) Google Scholar, Hell, 2003Hell S.W. Toward fluorescence nanoscopy.Nat. Biotechnol. 2003; 21: 1347-1355Crossref PubMed Scopus (778) Google Scholar). Although these methods significantly improve the resolution, they are still fundamentally limited by diffraction and have, in practice, achieved resolutions of ∼100 nm in all three dimensions (Hell, 2003Hell S.W. Toward fluorescence nanoscopy.Nat. Biotechnol. 2003; 21: 1347-1355Crossref PubMed Scopus (778) Google Scholar). The diffraction-limited resolution applies only to light that has propagated for a distance substantially larger than its wavelength (i.e., in the far field). Therefore, one route to bypass this constraint is to place the excitation source or detection probe (usually an optical fiber, a metal tip, or simply a small aperture) near the sample (i.e., in the near field) (Synge, 1928Synge E.H. A suggested method for extending microscopic resolution into the ultra-microscopic region.Philos. Mag. 1928; 6: 356-362Crossref Google Scholar). Indeed, near-field microscopy has achieved resolution substantially below 100 nm (Betzig et al., 1986Betzig E. Lewis A. Harootunian A. Isaacson M. Kratschmer E. Near-field scanning optical microscopy (NSOM) - Development and biophysical applications.Biophys. J. 1986; 49: 269-279Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (313) Google Scholar, Lewis et al., 1984Lewis A. Isaacson M. Harootunian A. Muray A. Development of a 500 Å spatial resolution light microscope.Ultramicroscopy. 1984; 13: 227-231Crossref Scopus (679) Google Scholar, Novotny and Hecht, 2006Novotny L. Hecht B. Principles of Nano-optics. Cambridge University Press, Cambridge2006Crossref Scopus (4493) Google Scholar, Pohl et al., 1984Pohl D.W. Denk W. Lanz M. Optical stethscopy - Image recording with resolution lembda/20.Appl. Phys. Lett. 1984; 44: 651-653Crossref Scopus (1833) Google Scholar). However, the requirement that the excitation source or detection probe be physically close to the target object (often within tens of nanometers) has made it difficult to look “into” a cell or a piece of tissue with near field microscopy, limiting the applications of this technique in biology. It was not until recently that several novel fluorescence microscopy approaches completely shattered the diffraction limit of image resolution in the far field. In general, all of these approaches generate “diffraction-unlimited images” by using the physical properties of fluorescent probes to distinguish emissions from two nearby molecules within a diffraction-limited region. These super-resolution approaches can be divided into two primary classes. The first category is ensemble imaging approaches that use patterned illumination to spatially modulate the fluorescence behavior of molecules within a diffraction-limited region, such that not all of them emit simultaneously, thereby achieving subdiffraction limit resolution. This category includes stimulated emission depletion (STED) microscopy (Hell and Wichmann, 1994Hell S.W. Wichmann J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.Opt. Lett. 1994; 19: 780-782Crossref PubMed Scopus (3813) Google Scholar, Klar and Hell, 1999Klar T.A. Hell S.W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy.Opt. Lett. 1999; 24: 954-956Crossref PubMed Scopus (555) Google Scholar) and the related RESOLFT technology (Hofmann et al., 2005Hofmann M. Eggeling C. Jakobs S. Hell S.W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy at low light intensities by using reversibly photoswitchable proteins.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005; 102: 17565-17569Crossref PubMed Scopus (592) Google Scholar), as well as saturated structured illumination microscopy (SSIM) (Gustafsson, 2005Gustafsson M.G.L. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005; 102: 13081-13086Crossref PubMed Scopus (1562) Google Scholar, Heintzmann et al., 2002Heintzmann R. Jovin T.M. Cremer C. Saturated patterned excitation microscopy—a concept for optical resolution improvement.J. Opt. Soc. Am. A Opt. Image Sci. Vis. 2002; 19: 1599-1609Crossref PubMed Scopus (444) Google Scholar). The second category takes advantages of single-molecule imaging, using photoswitching or other mechanisms to stochastically activate individual molecules within the diffraction-limited region at different times. Images with subdiffraction limit resolution are then reconstructed from the measured positions of individual fluorophores. This second class has been termed stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) (Rust et al., 2006Rust M.J. Bates M. Zhuang X.W. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).Nat. Methods. 2006; 3: 793-795Crossref PubMed Scopus (4953) Google Scholar), photoactivated localization microscopy (PALM) (Betzig et al., 2006Betzig E. Patterson G.H. Sougrat R. Lindwasser O.W. Olenych S. Bonifacino J.S. Davidson M.W. Lippincott-Schwartz J. Hess H.F. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.Science. 2006; 313: 1642-1645Crossref PubMed Scopus (5633) Google Scholar), and fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) (Hess et al., 2006Hess S.T. Girirajan T.P.K. Mason M.D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.Biophys. J. 2006; 91: 4258-4272Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2422) Google Scholar). Although these two categories of methods use different approaches to accomplish subdiffraction resolution, these techniques also share important commonalities. In both cases, a physical or chemical property of the fluorophore is used to maintain neighboring molecules in different states (i.e., “on” and “off”), enabling them to be resolved from each other (Hell, 2007Hell S.W. Far-field optical nanoscopy.Science. 2007; 316: 1153-1158Crossref PubMed Scopus (2170) Google Scholar). In this category of techniques, a patterned field of light is applied to the sample to manipulate its fluorescence emission. This spatial modulation can be implemented either in a “positive” or “negative” manner. In the positive case, the light field used to excite the sample and generate fluorescence is directly patterned. In contrast, the negative patterning approach enlists the help of an additional patterned light field to suppress the population of molecules that can fluoresce in the sample. In both of these approaches, the spatial information encoded into the illumination pattern allows neighboring fluorophores to be distinguished from each other, leading to enhanced spatial resolution. In STED microscopy, the patterned illumination prevents fluorophores from emitting light (Hell, 2007Hell S.W. Far-field optical nanoscopy.Science. 2007; 316: 1153-1158Crossref PubMed Scopus (2170) Google Scholar, Hell and Wichmann, 1994Hell S.W. Wichmann J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.Opt. Lett. 1994; 19: 780-782Crossref PubMed Scopus (3813) Google Scholar, Klar and Hell, 1999Klar T.A. Hell S.W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy.Opt. Lett. 1999; 24: 954-956Crossref PubMed Scopus (555) Google Scholar). This suppression is achieved by stimulated emission, a process in which a light source, called the depletion light, brings an excited fluorophore down to the lowest energy state (i.e., the ground state) before it can emit fluorescence signal. In practice, the depletion light is applied as a pattern surrounding the focal spot of the excitation laser. This reduces the size of the region of molecules that fluoresce, as if the “focal spot” of the microscope is sharpened (Figure 2A ). Scanning this sharpened spot across a sample then allows a super-resolution image to be recorded. Thus, this negative patterning approach elegantly generates a positive image without the need of any postacquisition processing. (A) In stimulated emission depletion (STED) microscopy, fluorophores are excited by a focused light beam (green, top layer), and an additional depletion light beam (red, second layer) is used to bring molecules back to the ground state by a process called stimulated emission. The intensity profile of this additional beam at the focal plane typically has a ring shape, depleting the population of molecules that can generate fluorescence, especially near the edge of the focal spot. The depletion efficiency can be described by the red pattern shown in the third layer when the depletion light intensity is above the saturation level. This depletion effect substantially reduces the size of the fluorescent spot (orange, bottom layer), thereby improving the image resolution. (B) Structured illumination microscopy (SIM) and saturated SIM (SSIM) use pattered illumination to excite the sample and generate fluorescence. This patterned excitation typically has a sinusoidal shape (green, top layer). Such illumination generates a similarly shaped fluorescence emission pattern when the fluorescence responds in a linear manner (orange, middle layer). With strong excitation, fluorescence saturates, generating a saturated emission profile with narrow dark regions (orange, bottom layer) that provide spatial information substantially beyond the diffraction limit. (C) Examples of STED images. (Top) Comparison between confocal (left) and STED (right) images of the outer membrane of mitochondria that is immunolabeled against the protein TOM20. Shown in the STED panel is an xy cross section of the 3D isoSTED image. (Bottom-left) Two-color isoSTED image of TOM20 (green) and the matrix protein HSP70 (red). (Bottom-right) Three-dimensional rendering of an isoSTED image of TOM20. Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd: Nature MethodsSchmidt et al., 2008Schmidt R. Wurm C.A. Jakobs S. Engelhardt J. Egner A. Hell S.W. Spherical nanosized focal spot unravels the interior of cells.Nat. Methods. 2008; 5: 539-544Crossref PubMed Scopus (306) Google Scholar. Reprinted with permission from Schmidt et al., 2009Schmidt R. Wurm C.A. Punge A. Egner A. Jakobs S. Hell S.W. Mitochondrial cristae revealed with focused light.Nano Lett. 2009; 9: 2508-2510Crossref PubMed Scopus (117) Google Scholar, American Chemical Society. (D) Examples of 3D SIM images. (Top) Central cross-section of a confocal image of the nucleus stained for DNA, lamin B, and the nuclear pore complex. DNA (blue) is stained with DAPI. Lamin B (green) and the nuclear pore complex (red) are immunostained. The right panels show the magnified images of the boxed region in the left panel. (Bottom) 3D SIM images of a similarly stained nucleus. From Schermelleh et al., 2008Schermelleh L. Carlton P.M. Haase S. Shao L. Winoto L. Kner P. Burke B. Cardoso M.C. Agard D.A. Gustafsson M.G.L. et al.Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.Science. 2008; 320: 1332-1336Crossref PubMed Scopus (817) Google Scholar. Reprinted with the permission from AAAS. It is important to note that the depletion light pattern itself is created by the same diffraction-limited optics. Therefore, if the fluorophores respond to the depletion light in a linear manner, the resolution enhancement would be rather limited. STED microscopy surpasses this limit by taking advantage of the saturated response of fluorophores: once the depletion laser intensity is above the saturation level, the number of fluorophores remaining in the excited state (and thus capable of generating fluorescence) approaches zero. Thus, when a ring-shaped depletion light pattern with peak intensity significantly above the saturation level is applied to the sample, only the molecules within a small region near the center of the ring can generate fluorescence (Figure 2A). The size of this region, and thus the resolution of the microscope, scales approximately with the inverse square root of the intensity of the depletion light (or δ≈Δ/1+Idep/Isat, wherein δ is the resolution, Δ is the diffraction-limited focal spot size, measured as the full width at half maximum intensity, and Idep is the intensity of the depletion laser) (Hell, 2007Hell S.W. Far-field optical nanoscopy.Science. 2007; 316: 1153-1158Crossref PubMed Scopus (2170) Google Scholar). In principle, this approach allows unlimited resolution improvement given an infinitely strong depletion light source. In practice, a number of factors influence the resolution of STED microscopy, including aberrations in the optics, scattering from the sample, and the photostability of the fluorophores. STED microscopy has reached a remarkable resolution of 6 nm using strong depletion intensity to image fluorescent defects in diamonds, which almost never photobleach (Rittweger et al., 2009Rittweger E. Han K.Y. Irvine S.E. Eggeling C. Hell S.W. STED microscopy reveals crystal colour centres with nanometric resolution.Nat. Photon. 2009; 3: 144-147Crossref Scopus (619) Google Scholar). On biological samples, STED imaging has achieved a resolution of 20 nm when using organic dyes and 50–70 nm resolution when using fluorescent proteins (http://www.mpibpc.mpg.de/groups/hell/STED_Dyes.html). In addition to stimulated emission, other saturable optical transitions that send the molecule to dark states can also be used to shrink the area of molecules that fluoresce in a focal spot (Bretschneider et al., 2007Bretschneider S. Eggeling C. Hell S.W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving.Phys. Rev. Lett. 2007; 98: 218103Crossref PubMed Scopus (246) Google Scholar, Hofmann et al., 2005Hofmann M. Eggeling C. Jakobs S. Hell S.W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy at low light intensities by using reversibly photoswitchable proteins.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005; 102: 17565-17569Crossref PubMed Scopus (592) Google Scholar). This extension of the STED approach, called reversible saturable optically linear fluorescence transitions (RESOLFT) microscopy, allows super resolution to be implemented with a substantially lower-depletion light intensity, causing less damage to delicate biological samples (Hell, 2007Hell S.W. Far-field optical nanoscopy.Science. 2007; 316: 1153-1158Crossref PubMed Scopus (2170) Google Scholar, Hofmann et al., 2005Hofmann M. Eggeling C. Jakobs S. Hell S.W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy at low light intensities by using reversibly photoswitchable proteins.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005; 102: 17565-17569Crossref PubMed Scopus (592) Google Scholar). Structured illumination microscopy (SIM) improves image resolution by using positive patterning of the excitation light (Heintzmann and Gustafsson, 2009Heintzmann R. Gustafsson M.G.L. Subdiffraction resolution in continuous samples.Nat. Photonics. 2009; 3: 362-364Crossref Scopus (132) Google Scholar), which is typically a sinusoidal pattern created by combining (i.e., interfering) two light beams. As the result, an image snapshot of the sample becomes the product of the sample structure itself and this excitation pattern (Figure 2B). A final image is then computationally reconstructed from multiple snapshots collected by scanning and rotating the pattern. In this process, the additional spatial modulation from the excitation pattern brings enhanced spatial resolution into the reconstructed image (Gustafsson, 2000Gustafsson M.G.L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.J. Microsc. 2000; 198: 82-87Crossref PubMed Scopus (2246) Google Scholar, Heintzmann and Cremer, 1999Heintzmann R. Cremer C. Lateral modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating.Proc. SPIE. 1999; 3568: 185-196Crossref Google Scholar). As is true for the depletion light pattern used in STED, the illumination pattern created by interference is also limited by diffraction. Therefore, when the fluorescence signal scales linearly with the intensity of the excitation light, SIM results only in a doubling of spatial resolution (Figure 2B), which is ∼100 nm in the lateral dimensions(Gustafsson, 2000Gustafsson M.G.L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.J. Microsc. 2000; 198: 82-87Crossref PubMed Scopus (2246) Google Scholar). Like with the negative patterning approach, the saturating response of the fluorophore can also be exploited here to further enhance the resolution (Gustafsson, 2005Gustafsson M.G.L. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005; 102: 13081-13086Crossref PubMed Scopus (1562) Google Scholar, Heintzmann et al., 2002Heintzmann R. Jovin T.M. Cremer C. Saturated patterned excitation microscopy—a concept for optical resolution improvement.J. Opt. Soc. Am. A Opt. Image Sci. Vis. 2002; 19: 1599-1609Crossref PubMed Scopus (444) Google Scholar). With sufficiently strong excitation, the fluorescence emission from a fluorophore will saturate. Saturated SIM (SSIM) utilizes this phenomenon to create sharp dark regions where the excitation pattern has zero intensity, providing image resolution significantly beyond the diffraction limit (Figure 2B). With this approach, a resolution of 50 nm has been obtained for imaging fluorescence microspheres (Gustafsson, 2005Gustafsson M.G.L. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005; 102: 13081-13086Crossref PubMed Scopus (1562) Google Scholar). The basic form of SIM (i.e., the linear form) does not rely on any special photophysics of the fluorophores but purely on the optics of the microscope. Therefore, any fluorescent probe that is compatible with conventional fluorescence imaging is compatible with SIM. In addition, multicolor imaging can be achieved with SIM as it is with conventional fluorescence microscopy. Up to four colors can be imaged in the visible to near infrared (IR) spectrum range without incurring much crosstalk between the different color channels. As an example, Figure 2D shows a three-color SIM image of DNA, lamin B, and nuclear pore complexes in the nucleus (Schermelleh et al., 2008Schermelleh L. Carlton P.M. Haase S. Shao L. Winoto L. Kner P. Burke B. Cardoso M.C. Agard D.A. Gustafsson M.G.L. et al.Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.Science. 2008; 320: 1332-1336Crossref PubMed Scopus (817) Google Scholar). In contrast, SSIM requires special fluorophores that have high photostability because the fluorophores are maintained in the highly reactive excited state most of the time in this imaging scheme. STED microscopy can also use a wide range of existing fluorescent probes because all fluorophores can undergo stimulated emission (http://www.mpibpc.mpg.de/groups/hell/STED_Dyes.html). In practice, dyes that are photostable under a strong depletion light, such as Atto 647N, Atto 590, and Atto 565, provide greater resolution enhancement. Fluorescent proteins such as enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) and Citrine have also been used. However, multicolor imaging with STED is less flexible compared to conventional fluorescence microscopy. To image one fluorophore, STED microscopy requires two lasers at the opposite ends of the absorption and emission spectra of the fluorophore for excitation and depletion, respectively. Therefore, the number of colors that can fit into the visible to near IR spectrum range is limited, and a maximum of two colors has been imaged simultaneously thus far (Donnert et al., 2007Donnert G. Keller J. Wurm C.A. Rizzoli S.O. Westphal V. Schönle A. Jahn R. Jakobs S. Eggeling C. Hell S.W. Two-color far-field fluorescence nanoscopy.Biophys. J. 2007; 92: L67-L69Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (190) Google Scholar, Schmidt et al., 2008Schmidt R. Wurm C.A. Jakobs S. Engelhardt J. Egner A. Hell S.W. Spherical nanosized focal spot unravels the interior of cells.Nat. Methods. 2008; 5: 539-544Crossref PubMed Scopus (306) Google Scholar). Figure 2C shows a two-color STED image of the mitochondrial outer-membrane protein TOM20 and matrix protein HSP70 obtained using the latter approach (Schmidt et al., 2008Schmidt R. Wurm C.A. Jakobs S. Engelhardt J. Egner A. Hell S.W. Spherical nanosized focal spot unravels the interior of cells.Nat. Methods. 2008; 5: 539-544Crossref PubMed Scopus (306) Google Scholar). The depletion pattern in STED microscopy is created by inserting a spatial light modulator in the laser beam before it enters the microscope. As a ring-shaped pattern in the x-y plane improves the lateral resolution, a pattern having two maxima along the z axis improves the axial resolution (Hell, 2003Hell S.W. Toward fluorescence nanoscopy.Nat. Biotechnol. 2003; 21: 1347-1355Crossref PubMed Scopus (778) Google Scholar). Overlaying these two patterns improves the resolution in both lateral and axial directions (Harke et al., 2008Harke B. Ullal C.K. Keller J. Hell S.W. Three-dimensional nanoscopy of colloidal crystals.Nano Lett. 2008; 8: 1309-1313Crossref PubMed Scopus (143) Google Scholar), allowing three-dimensional (3D) super-resolution imaging with a z resolution ∼2.5 times the xy resolution. Subsequently, isoSTED has been realized with the z depletion pattern generated by two opposing objectives using the 4Pi configuration, reaching a resolution as high as ∼30 nm in all three dimensions, as demonstrated by the 3D images of mitochondria shown in Figure 2C (Schmidt et al., 2008Schmidt R. Wurm

Mapping the brain, one neuron at a time Spatial transcriptomics can link molecularly described cell types to their anatomical positions and functional roles. Moffitt et al. used a combination of single-cell RNA-sequencing and MERFISH (multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization) to map the identity and location of specific cell types within the mouse preoptic hypothalamus and surrounding areas of the brain (see the Perspective by Tasic and Nicovich). They related these cell types to specific behaviors via gene activity. The approach provides an unbiased description of cell types of the preoptic area, which are important for sleep, thermoregulation, thirst, and social behavior. Science , this issue p. eaau5324 ; see also p. 749

Using super-resolution imaging to directly observe the three-dimensional organization of Drosophila chromatin at a scale spanning sizes from individual genes to entire gene regulatory domains, the authors find that transcriptionally active, inactive and Polycomb-repressed chromatin states each have a distinct spatial organisation. How chromatin is folded in the nucleus has important implications for many biological processes, from the regulation of gene expression to DNA replication. Here Xiaowei Zhuang and colleagues use super-resolution imaging to directly observe the organization of Drosophila chromatin at a scale spanning the sizes of individual genes and gene regulatory domains. They find that transcriptionally active, inactive, and Polycomb-repressed chromatin states each have a distinct spatial organization. Transcriptionally inactive chromatin resembles the fractal globule state of a polymer, whereas Polycomb domains have a unique compact organization and spatial isolation from other domains, explaining why gene expression is so strongly repressed in this state. Metazoan genomes are spatially organized at multiple scales, from packaging of DNA around individual nucleosomes to segregation of whole chromosomes into distinct territories1,2,3,4,5. At the intermediate scale of kilobases to megabases, which encompasses the sizes of genes, gene clusters and regulatory domains, the three-dimensional (3D) organization of DNA is implicated in multiple gene regulatory mechanisms2,3,4,6,7,8, but understanding this organization remains a challenge. At this scale, the genome is partitioned into domains of different epigenetic states that are essential for regulating gene expression9,10,11. Here we investigate the 3D organization of chromatin in different epigenetic states using super-resolution imaging. We classified genomic domains in Drosophila cells into transcriptionally active, inactive or Polycomb-repressed states, and observed distinct chromatin organizations for each state. All three types of chromatin domains exhibit power-law scaling between their physical sizes in 3D and their domain lengths, but each type has a distinct scaling exponent. Polycomb-repressed domains show the densest packing and most intriguing chromatin folding behaviour, in which chromatin packing density increases with domain length. Distinct from the self-similar organization displayed by transcriptionally active and inactive chromatin, the Polycomb-repressed domains are characterized by a high degree of chromatin intermixing within the domain. Moreover, compared to inactive domains, Polycomb-repressed domains spatially exclude neighbouring active chromatin to a much stronger degree. Computational modelling and knockdown experiments suggest that reversible chromatin interactions mediated by Polycomb-group proteins play an important role in these unique packaging properties of the repressed chromatin. Taken together, our super-resolution images reveal distinct chromatin packaging for different epigenetic states at the kilobase-to-megabase scale, a length scale that is directly relevant to genome regulation.