Most human epithelial tumors harbor numerous alterations, making it difficult to predict which genes are required for tumor survival. To systematically identify cancer dependencies, we analyzed 501 genome-scale loss-of-function screens performed in diverse human cancer cell lines. We developed DEMETER, an analytical framework that segregates on- from off-target effects of RNAi. 769 genes were differentially required in subsets of these cell lines at a threshold of six SDs from the mean. We found predictive models for 426 dependencies (55%) by nonlinear regression modeling considering 66,646 molecular features. Many dependencies fall into a limited number of classes, and unexpectedly, in 82% of models, the top biomarkers were expression based. We demonstrated the basis behind one such predictive model linking hypermethylation of the UBB ubiquitin gene to a dependency on UBC. Together, these observations provide a foundation for a cancer dependency map that facilitates the prioritization of therapeutic targets.

Abstract The creation of genome-wide libraries for CRISPR knockout (CRISPRko), interference (CRISPRi), and activation (CRISPRa) has enabled the systematic interrogation of gene function. Here, we show that our recently-described CRISPRko library (Brunello) is more effective than previously published libraries at distinguishing essential and non-essential genes, providing approximately the same perturbation-level performance improvement over GeCKO libraries as GeCKO provided over RNAi. Additionally, we present genome-wide libraries for CRISPRi (Dolcetto) and CRISPRa (Calabrese), and show in negative selection screens that Dolcetto, with fewer sgRNAs per gene, outperforms existing CRISPRi libraries and achieves comparable performance to CRISPRko in detecting essential genes. We also perform positive selection CRISPRa screens and demonstrate that Calabrese outperforms the SAM approach at identifying vemurafenib resistance genes. We further compare CRISPRa to genome-scale libraries of open reading frames (ORFs). Together, these libraries represent a suite of genome-wide tools to efficiently interrogate gene function with multiple modalities.

Abstract The CRISPR/Cas9 system enables genome editing and somatic cell genetic screens in mammalian cells. We performed genome-scale loss-of-function screens in 33 cancer cell lines to identify genes essential for proliferation/survival and found a strong correlation between increased gene copy number and decreased cell viability after genome editing. Within regions of copy-number gain, CRISPR/Cas9 targeting of both expressed and unexpressed genes, as well as intergenic loci, led to significantly decreased cell proliferation through induction of a G2 cell-cycle arrest. By examining single-guide RNAs that map to multiple genomic sites, we found that this cell response to CRISPR/Cas9 editing correlated strongly with the number of target loci. These observations indicate that genome targeting by CRISPR/Cas9 elicits a gene-independent antiproliferative cell response. This effect has important practical implications for the interpretation of CRISPR/Cas9 screening data and confounds the use of this technology for the identification of essential genes in amplified regions. Significance: We found that the number of CRISPR/Cas9-induced DNA breaks dictates a gene-independent antiproliferative response in cells. These observations have practical implications for using CRISPR/Cas9 to interrogate cancer gene function and illustrate that cancer cells are highly sensitive to site-specific DNA damage, which may provide a path to novel therapeutic strategies. Cancer Discov; 6(8); 914–29. ©2016 AACR. See related commentary by Sheel and Xue, p. 824. See related article by Munoz et al., p. 900. This article is highlighted in the In This Issue feature, p. 803

Unlike most tumor suppressor genes, the most common genetic alterations in tumor protein p53 (TP53) are missense mutations1,2. Mutant p53 protein is often abundantly expressed in cancers and specific allelic variants exhibit dominant-negative or gain-of-function activities in experimental models3–8. To gain a systematic view of p53 function, we interrogated loss-of-function screens conducted in hundreds of human cancer cell lines and performed TP53 saturation mutagenesis screens in an isogenic pair of TP53 wild-type and null cell lines. We found that loss or dominant-negative inhibition of wild-type p53 function reliably enhanced cellular fitness. By integrating these data with the Catalog of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC) mutational signatures database9,10, we developed a statistical model that describes the TP53 mutational spectrum as a function of the baseline probability of acquiring each mutation and the fitness advantage conferred by attenuation of p53 activity. Collectively, these observations show that widely-acting and tissue-specific mutational processes combine with phenotypic selection to dictate the frequencies of recurrent TP53 mutations. Large-scale loss-of-function screens and TP53 saturation mutagenesis screens in human cancer cell lines suggest that mutational processes combine with phenotypic selection to shape the landscape of somatic mutations at the TP53 locus.

Abstract Image-based profiling has emerged as a powerful technology for various steps in basic biological and pharmaceutical discovery, but the community has lacked a large, public reference set of data from chemical and genetic perturbations. Here we present data generated by the Joint Undertaking for Morphological Profiling (JUMP)-Cell Painting Consortium, a collaboration between 10 pharmaceutical companies, six supporting technology companies, and two non-profit partners. When completed, the dataset will contain images and profiles from the Cell Painting assay for over 116,750 unique compounds, over-expression of 12,602 genes, and knockout of 7,975 genes using CRISPR-Cas9, all in human osteosarcoma cells (U2OS). The dataset is estimated to be 115 TB in size and capturing 1.6 billion cells and their single-cell profiles. File quality control and upload is underway and will be completed over the coming months at the Cell Painting Gallery: https://registry.opendata.aws/cellpainting-gallery . A portal to visualize a subset of the data is available at https://phenaid.ardigen.com/jumpcpexplorer/ .

Abstract Identifying genetic and chemical perturbations with similar impacts on cell morphology can reveal compounds’ mechanisms of action or novel regulators of genetic pathways. Research on methods for identifying such similarities has lagged due to a lack of carefully designed and well-annotated image sets of cells treated with chemical and genetic perturbations. Here, we create such a Resource dataset, CPJUMP1, where each perturbed gene is a known target of at least two chemical compounds in the dataset. We systematically explore the directionality of correlations among perturbations that target the same gene, and we find that identifying matches between chemical perturbations and genetic perturbations is a challenging task. Our dataset and baseline analyses provide a benchmark for evaluating methods that measure perturbation similarities and impact, and more generally, learn effective representations of cellular state from microscopy images. Such advancements would accelerate the applications of image-based profiling, such as functional genomics and drug discovery.

Abstract In image-based profiling, software extracts thousands of morphological features of cells from multi-channel fluorescence microscopy images, yielding single-cell profiles that can be used for basic research and drug discovery. Powerful applications have been proven, including clustering chemical and genetic perturbations based on their similar morphological impact, identifying disease phenotypes by observing differences in profiles between healthy and diseased cells, and predicting assay outcomes using machine learning, among many others. Here we provide an updated protocol for the most popular assay for image-based profiling, Cell Painting. Introduced in 2013, it uses six stains imaged in five channels and labels eight diverse components of the cell: DNA, cytoplasmic RNA, nucleoli, actin, Golgi apparatus, plasma membrane, endoplasmic reticulum, and mitochondria. The original protocol was updated in 2016 based on several years’ experience running it at two sites, after optimizing it by visual stain quality. Here we describe the work of the Joint Undertaking for Morphological Profiling (JUMP) Cell Painting Consortium, aiming to improve upon the assay via quantitative optimization, based on the measured ability of the assay to detect morphological phenotypes and group similar perturbations together. We find that the assay gives very robust outputs despite a variety of changes to the protocol and that two vendors’ dyes work equivalently well. We present Cell Painting version 3, in which some steps are simplified and several stain concentrations can be reduced, saving costs. Cell culture and image acquisition take 1–2 weeks for a typically sized batch of 20 or fewer plates; feature extraction and data analysis take an additional 1–2 weeks. Key references using this protocol Virtual screening for small-molecule pathway regulators by image-profile matching ( https://doi.org/10.1016/j.cels.2022.08.003 ) - recent work examining the ability to use collected Cell Painting profiles to screen for regulators of a number of diverse biological pathways. JUMP Cell Painting dataset: images and profiles from two billion cells perturbed by 140,000 chemical and genetic perturbations (DOI) - the description of the main JUMP master public data set, using this protocol in the production of >200 TB of image data and >200 TB of measured profiles. Key data used in this protocol Cell Painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes ( https://doi.org/10.1038/nprot.2016.105 ) - this paper provides the first step-by-step Cell Painting protocol ever released.

Abstract Since the KIAA1549::BRAF fusion was discovered as the most common driver of pediatric low-grade glioma (pLGG), it has been hypothesized that the fusion induces oncogenicity through BRAF activation as a result of KIAA1549 replacing the BRAF negative regulatory N-terminus. This led to the rapid translation of MAPK pathway inhibitors into the clinical setting. Despite most tumors exhibiting promising initial responses, some tumors are not sensitive and about half of responsive tumors grow back after treatment cessation. Therefore, strategies that result in sustained tumor responses are desperately needed. We have recently performed genome-scale CRISPR/Cas9 screens across isogenic neural stem cell models transduced to express pLGG-associated oncogenes (KIAA1549::BRAF, BRAFV600E, and multiple FGFR1 and MYB family alterations) to generate a dependency map of genetic vulnerabilities associated with expression of these oncogenes. We also included normal neural stem cells to allow identification of genetic dependencies specifically induced by the expression of each oncogene. Surprisingly, through these efforts, we have discovered KIAA1549::BRAF expressing cells to harbor striking and specific dependency on multiple members of an enzymatic complex that exerts its activity outside of the MAPK signaling axis*. Interestingly, this enzymatic complex has been described to modify only a few substrates, including KIAA1549, suggesting specificity. We have now validated this dependency across other isogenic models of KIAA1549::BRAF-expressing cells. Finally, our KIAA1549::BRAF-expressing models exhibit preferential sensitivity to a tool compound that targets our novel enzyme, suggesting novel therapeutic potential for KIAA1549::BRAF. These findings highlight a MAPK pathway-independent avenue for therapeutically targeting the most frequent genomic alterations in pediatric brain tumors. Consequently, we also propose that the fusion partner KIAA1549 is instrumental for the aberrant BRAF signaling driving pLGGs. (* we are currently in the process of working with our IP offices to ensure that we can disclose the names of the genes and proteins at the ISPNO meeting)

The CRISPR-Cas9 system has revolutionized gene editing both on single genes and in multiplexed loss-of-function screens, enabling precise genome-scale identification of genes essential to proliferation and survival of cancer cells. However, previous studies reported that an anti-proliferative effect of Cas9-mediated DNA cleavage confounds such measurement of genetic dependency, particularly in the setting of copy number gain. We performed genome-scale CRISPR-Cas9 essentiality screens on 342 cancer cell lines and found that this effect is common to all lines, leading to false positive results when targeting genes in copy number amplified regions. We developed CERES, a computational method to estimate gene dependency levels from CRISPR-Cas9 essentiality screens while accounting for the copy-number-specific effect, as well as variable sgRNA activity. We applied CERES to sets of screens performed with different sgRNA libraries and found that it reduces false positive results and provides meaningful estimates of sgRNA activity. As a result, the application of CERES improves confidence in the interpretation of genetic dependency data from CRISPR-Cas9 essentiality screens of cancer cell lines.

ABSTRACT Cas12a CRISPR technology, unlike Cas9, allows for facile multiplexing of guide RNAs from a single transcript, simplifying combinatorial perturbations. While Cas12a has been implemented for multiplexed knockout genetic screens, it has yet to be optimized for CRISPR activation (CRISPRa) screens in human cells. Here we develop a new Cas12a-based transactivation domain (TAD) recruitment system using the ALFA nanobody and demonstrate simultaneous activation of up to four genes. We screen a genome-wide library to identify modulators of growth and MEK inhibition and we compare these results to those obtained with open reading frame (ORF) overexpression and Cas9-based CRISPRa. We find that the activity of multiplexed arrays is largely predictable from the best-performing guide and provide criteria for selecting active guides. We anticipate that these results will greatly accelerate the exploration of gene function and combinatorial phenotypes at scale.