Abstract The papain-like protease (PL pro ) in coronavirus is one of key cysteine proteases responsible for the proteolytic processing of viral polyproteins, and plays an important role in dysregulation of host immune response. PL pro is a promising therapeutic target with a major challenge in inhibitor design due to the restricted S1/S2 sites for two consecutive glycine of substrates. Here we reported the discovery of two activators of the SARS-CoV-2 PL pro from a biochemical screening, and the identification of the unique residue, C270, as an allosteric and covalent regulation site for the activators. This site was also specifically modified by glutathione oxidized, resulting in the S-glutathionylation and activation of the protease. Furthermore, one compound was found to allosterically inhibit the protease by covalent binding to this crucial site. Together, these results elucidated an unrevealed molecular mechanism for allosteric modulation of the protease’s activity, and provided a new strategy for discovery of allosteric inhibitors of the SARS-CoV-2 PL pro .

A new coronavirus (CoV) identified as COVID-19 virus is the etiological agent responsible for the 2019-2020 viral pneumonia outbreak that commenced in Wuhan[1][1]–[4][2]. Currently there is no targeted therapeutics and effective treatment options remain very limited. In order to rapidly discover lead compounds for clinical use, we initiated a program of combined structure-assisted drug design, virtual drug screening and high-throughput screening to identify new drug leads that target the COVID-19 virus main protease (Mpro). Mpro is a key CoV enzyme, which plays a pivotal role in mediating viral replication and transcription, making it an attractive drug target for this virus[5][3],[6][4]. Here, we identified a mechanism-based inhibitor, N3, by computer-aided drug design and subsequently determined the crystal structure of COVID-19 virus Mpro in complex with this compound. Next, through a combination of structure-based virtual and high-throughput screening, we assayed over 10,000 compounds including approved drugs, drug candidates in clinical trials, and other pharmacologically active compounds as inhibitors of Mpro. Six of these inhibit Mpro with IC50 values ranging from 0.67 to 21.4 μM. Ebselen also exhibited promising antiviral activity in cell-based assays. Our results demonstrate the efficacy of this screening strategy, which can lead to the rapid discovery of drug leads with clinical potential in response to new infectious diseases where no specific drugs or vaccines are available. [1]: #ref-1 [2]: #ref-4 [3]: #ref-5 [4]: #ref-6

Human infections with severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) cause coronavirus disease 19 (COVID-19) and there is currently no cure. The 3C-like protease (3CLpro), a highly conserved protease indispensable for replication of coronaviruses, is a promising target for development of broad-spectrum antiviral drugs. To advance the speed of drug discovery and development, we investigated the inhibition of SARS-CoV-2 3CLpro by natural products derived from Chinese traditional medicines. Baicalin and baicalein were identified as the first non-covalent, non-peptidomimetic inhibitors of SARS-CoV-2 3CLpro and exhibited potent antiviral activities in a cell-based system. Remarkably, the binding mode of baicalein with SARS-CoV-2 3CLpro determined by X-ray protein crystallography is distinctly different from those of known inhibitors. Baicalein is perfectly ensconced in the core of the substrate-binding pocket by interacting with two catalytic residues, the crucial S1/S2 subsites and the oxyanion loop, acting as a 'shield' in front of the catalytic dyad to prevent the peptide substrate approaching the active site. The simple chemical structure, unique mode of action, and potent antiviral activities in vitro, coupled with the favorable safety data from clinical trials, emphasize that baicalein provides a great opportunity for the development of critically needed anti-coronaviral drugs.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

The pandemic of Corona Virus Disease 2019 (COVID-19) caused by SARS-CoV-2 has become a global crisis. The replication of SARS-CoV-2 requires the viral RNA-dependent RNA polymerase (RdRp), a direct target of the antiviral drug, Remdesivir. Here we report the structure of the SARS-CoV-2 RdRp either in the apo form or in complex with a 50-base template-primer RNA and Remdesivir at a resolution range of 2.5-2.8 Å. The complex structure reveals that the partial double-stranded RNA template is inserted into the central channel of the RdRp where Remdesivir is incorporated into the first replicated base pair and terminates the chain elongation. Our structures provide critical insights into the working mechanism of viral RNA replication and a rational template for drug design to combat the viral infection.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

Abstract Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is the etiological agent responsible for the worldwide coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak. Investigation has confirmed that polysaccharide heparan sulfate can bind to the spike protein and block SARS-CoV-2 infection. Theoretically, similar structure of nature polysaccharides may also have the impact on the virus. Indeed, some marine polysaccharide has been reported to inhibit SARS-Cov-2 infection in vitro , however the convinced targets and mechanism are still vague. By high throughput screening to target 3CLpro enzyme, a key enzyme that plays a pivotal role in the viral replication and transcription using nature polysaccharides library, we discover the mixture polysaccharide 375 from seaweed Ecklonia kurome Okam completely block 3Clpro enzymatic activity (IC 50 , 0.48 µM). Further, the homogeneous polysaccharide 37502 from the 375 may bind to 3CLpro molecule well (kD value : 4.23 × 10 −6 ). Very interestingly, 37502 also can potently disturb spike protein binding to ACE2 receptor (EC 50 , 2.01 µM). Importantly, polysaccharide 375 shows good anti-SARS-CoV-2 infection activity in cell culture with EC 50 values of 27 nM (99.9% inhibiting rate at the concentration of 20 µg/mL), low toxicity (LD 50 : 136 mg/Kg on mice). By DEAE ion-exchange chromatography, 37501, 37502 and 37503 polysaccharides are purified from native 375. Bioactivity test show that 37501 and 37503 may impede SARS-Cov-2 infection and virus replication, however their individual impact on the virus is significantly less that of 375. Surprisingly, polysaccharide 37502 has no inhibition effect on SARS-Cov-2. The structure study based on monosaccharide composition, methylation, NMR spectrum analysis suggest that 375 contains guluronic acid, mannuronic acid, mannose, rhamnose, glucouronic acid, galacturonic acid, glucose, galactose, xylose and fucose with ratio of 1.86 : 9.56 : 6.81 : 1.69 : 1.00 : 1.75 : 1.19 : 11.06 : 4.31 : 23.06. However, polysaccharide 37502 is an aginate which composed of mannuronic acid (89.3 %) and guluronic acid (10.7 %), with the molecular weight ( Mw ) of 27.9 kDa. These results imply that mixture polysaccharides 375 works better than the individual polysaccharide on SARS-Cov-2 may be the cocktail-like polysaccharide synergistic function through targeting multiple key molecules implicated in the virus infection and replication. The results also suggest that 375 may be a potential drug candidate against SARS-CoV-2.