To better understand host-virus genetic dependencies and find potential therapeutic targets for COVID-19, we performed a genome-scale CRISPR loss-of-function screen to identify host factors required for SARS-CoV-2 viral infection of human alveolar epithelial cells. Top-ranked genes cluster into distinct pathways, including the vacuolar ATPase proton pump, Retromer, and Commander complexes. We validate these gene targets using several orthogonal methods such as CRISPR knockout, RNA interference knockdown, and small-molecule inhibitors. Using single-cell RNA-sequencing, we identify shared transcriptional changes in cholesterol biosynthesis upon loss of top-ranked genes. In addition, given the key role of the ACE2 receptor in the early stages of viral entry, we show that loss of RAB7A reduces viral entry by sequestering the ACE2 receptor inside cells. Overall, this work provides a genome-scale, quantitative resource of the impact of the loss of each host gene on fitness/response to viral infection.

Type VI CRISPR enzymes are RNA-targeting proteins with nuclease activity that enable specific and robust target gene knockdown without altering the genome. To define rules for the design of Cas13d guide RNAs (gRNAs), we conducted massively parallel screens targeting messenger RNAs (mRNAs) of a green fluorescent protein transgene, and CD46, CD55 and CD71 cell-surface proteins in human cells. In total, we measured the activity of 24,460 gRNAs with and without mismatches relative to the target sequences. Knockdown efficacy is driven by gRNA-specific features and target site context. Single mismatches generally reduce knockdown to a modest degree, but spacer nucleotides 15–21 are largely intolerant of target site mismatches. We developed a computational model to identify optimal gRNAs and confirm their generalizability, testing 3,979 guides targeting mRNAs of 48 endogenous genes. We show that Cas13 can be used in forward transcriptomic pooled screens and, using our model, predict optimized Cas13 gRNAs for all protein-coding transcripts in the human genome. Design of optimal guide RNAs for Cas13d-mediated RNA knockdown is enabled by computational modeling of large-scale screening data.

A novel variant of the SARS-CoV-2 virus carrying a point mutation in the Spike protein (D614G) has recently emerged and rapidly surpassed others in prevalence. This mutation is in linkage disequilibrium with an ORF1b protein variant (P314L), making it difficult to discern the functional significance of the Spike D614G mutation from population genetics alone. Here, we perform site-directed mutagenesis on wild-type human-codon-optimized Spike to introduce the D614G variant. Using multiple human cell lines, including human lung epithelial cells, we found that the lentiviral particles pseudotyped with Spike D614G are more effective at transducing cells than ones pseudotyped with wild-type Spike. The increased transduction with Spike D614G ranged from 1.3- to 2.4-fold in Caco-2 and Calu-3 cells expressing endogenous ACE2 and from 1.5- to 7.7-fold in A549 ACE2 and Huh7.5 ACE2 overexpressing ACE2. Furthermore, trans -complementation of SARS-CoV-2 virus with Spike D614G showed an increased infectivity in human cells. Although there is minimal difference in ACE2 receptor binding between the D614 and G614 Spike variants, the G614 variant is more resistant to proteolytic cleavage, suggesting a possible mechanism for the increased transduction.

The engineering of autologous patient T cells for adoptive cell therapies has revolutionized the treatment of several types of cancer1. However, further improvements are needed to increase response and cure rates. CRISPR-based loss-of-function screens have been limited to negative regulators of T cell functions2–4 and raise safety concerns owing to the permanent modification of the genome. Here we identify positive regulators of T cell functions through overexpression of around 12,000 barcoded human open reading frames (ORFs). The top-ranked genes increased the proliferation and activation of primary human CD4+ and CD8+ T cells and their secretion of key cytokines such as interleukin-2 and interferon-γ. In addition, we developed the single-cell genomics method OverCITE-seq for high-throughput quantification of the transcriptome and surface antigens in ORF-engineered T cells. The top-ranked ORF—lymphotoxin-β receptor (LTBR)—is typically expressed in myeloid cells but absent in lymphocytes. When overexpressed in T cells, LTBR induced profound transcriptional and epigenomic remodelling, leading to increased T cell effector functions and resistance to exhaustion in chronic stimulation settings through constitutive activation of the canonical NF-κB pathway. LTBR and other highly ranked genes improved the antigen-specific responses of chimeric antigen receptor T cells and γδ T cells, highlighting their potential for future cancer-agnostic therapies5. Our results provide several strategies for improving next-generation T cell therapies by the induction of synthetic cell programmes. A genome-scale gain-of-function screen using overexpression of nearly 12,000 open reading frames (ORFs) identifies positive regulators of human T cell function and suggests that ORF-based screens could be applied clinically to improve T cell therapies.

Abstract The majority of variants associated with complex traits and common diseases identified by genome-wide association studies (GWAS) map to noncoding regions of the genome with unknown regulatory effects in cis and trans . By leveraging biobank-scale GWAS data, massively parallel CRISPR screens and single cell transcriptome sequencing, we discovered target genes of noncoding variants for blood trait loci. The closest gene was often the target gene, but this was not always the case. We also identified trans -effects networks of noncoding variants when cis target genes encoded transcription factors, such as GFI1B and NFE2 . We observed that GFI1B trans -target genes were enriched for GFI1B binding sites and fine-mapped GWAS variants, and expressed in human bone marrow progenitor cells, suggesting that GFI1B acts as a master regulator of blood traits. This platform will enable massively parallel assays to catalog the target genes of human noncoding variants in both cis and trans .

Abstract Type VI CRISPR enzymes have recently been identified as programmable RNA-guided, RNA-targeting Cas proteins with nuclease activity that allow for specific and robust target gene knock-down without altering the genome. However, we currently lack information about optimal Cas13 guide RNA designs for high target RNA knock-down efficacy. To close this gap, we conducted four massively-parallel Cas13 screens targeting the mRNA of a destabilized green fluorescent protein (GFP) transgene and CD46, CD55 and CD71 cell surface proteins in human cells. In total, we measured the activity of 24,460 guide RNA including 6,469 perfect match guide RNAs and a diverse set of guide RNA variants and permutations with mismatches relative to the target sequences. We find that guide RNAs show high diversity in knock-down efficiency driven by crRNA-specific features as well as target site context. Moreover, while single mismatches generally reduce knock-down to a modest degree, we identify a critical region spanning spacer nucleotides 15 – 21 that is largely intolerant to target site mismatches. We developed a computational model to identify guide RNAs with high knock-down efficacy. We confirmed the model’s generalizability across a large number of endogenous target mRNAs and show that Cas13 can be used in forward genetic pooled CRISPR-screens to identify essential genes. Using this model, we provide a resource of optimized Cas13 guide RNAs to target all protein-coding transcripts in the human genome, enabling transcriptome-wide forward genetic screens.

A key limitation of the commonly-used CRISPR enzyme S. pyogenes Cas9 is the strict requirement of an NGG protospacer-adjacent motif (PAM) at the target site, which reduces the number of accessible genomic loci. This constraint can be limiting for genome editing applications that require precise Cas9 positioning. Recently, two Cas9 variants with a relaxed PAM requirement (NG) have been developed (xCas9 and Cas9-NG) but their activity has been measured at only a small number of endogenous sites. Here we devised a high-throughput Cas9 pooled competition screen to compare the performance of both PAM-flexible Cas9 variants and wild-type Cas9 at thousands of genomic loci and across 3 modalities (gene knock-out, transcriptional activation and suppression). We show that PAM flexibility comes at a substantial cost of decreased DNA targeting and cutting. Of the PAM-flexible variants, we found that Cas9-NG outperforms xCas9 regardless of genome engineering modality or PAM. Finally, we combined xCas9 mutations with those of Cas9-NG, creating a stronger transcriptional modulator than existing PAM-flexible Cas9 variants.

Abstract A novel isolate of the SARS-CoV-2 virus carrying a point mutation in the Spike protein (D614G) has recently emerged and rapidly surpassed others in prevalence. This mutation is in linkage disequilibrium with an ORF1b protein variant (P314L), making it difficult to discern the functional significance of the Spike D614G mutation from population genetics alone. Here, we perform site-directed mutagenesis to introduce the D614G variant and show that in multiple cell lines, including human lung epithelial cells, that the D614G mutation is up to 8-fold more effective at transducing cells than wild-type. We demonstrate increased infection using both Spike-pseudotyped lentivirus and intact SARS-CoV-2 virus. Although there is minimal difference in ACE2 receptor binding between the Spike variants, we show that the G614 variant is more resistant to proteolytic cleavage in vitro and in human cells, suggesting a possible mechanism for the increased transduction. This result has important implications for the efficacy of Spike-based vaccines currently under development in protecting against this recent and highly-prevalent SARS-CoV-2 isolate.