Another host factor for SARS-CoV-2 Virus-host interactions determine cellular entry and spreading in tissues. Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) and the earlier SARS-CoV use angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) as a receptor; however, their tissue tropism differs, raising the possibility that additional host factors are involved. The spike protein of SARS-CoV-2 contains a cleavage site for the protease furin that is absent from SARS-CoV (see the Perspective by Kielian). Cantuti-Castelvetri et al. now show that neuropilin-1 (NRP1), which is known to bind furin-cleaved substrates, potentiates SARS-CoV-2 infectivity. NRP1 is abundantly expressed in the respiratory and olfactory epithelium, with highest expression in endothelial and epithelial cells. Daly et al. found that the furin-cleaved S1 fragment of the spike protein binds directly to cell surface NRP1 and blocking this interaction with a small-molecule inhibitor or monoclonal antibodies reduced viral infection in cell culture. Understanding the role of NRP1 in SARS-CoV-2 infection may suggest potential targets for future antiviral therapeutics. Science , this issue p. 856 , p. 861 ; see also p. 765

Human hepatitis D virus (hHDV) forms the genus Deltavirus which has not been assigned to any virus family. hHDV is a satellite virus and needs hepatitis B virus (HBV) to make infectious particles. Deltaviruses are thought to have evolved in humans, since they have thus far not been identified elsewhere. Herein we report, prompted by a recent observation of HDV-like agent in birds, the identification of a deltavirus in a snake (Boa constrictor) designated as snake-HDV (sHDV). The circular 1711 nt RNA genome of the newly identified virus resembles hHDV in its coding strategy and size. We discovered sHDV when performing a meta-transcriptomic study on brain samples of two boas with central nervous system signs. We did not identify accompanying HBV-like sequences in the samples. By sequence comparison, the putative hepatitis D antigen (HDAg) of sHDV, encoded by one of the two open reading frames (ORFs), is roughly 50% identical to the previously known HDAgs. We used antiserum raised against recombinant snake HDAg to demonstrate a broad viral target cell spectrum, ranging from neurons over epithelial cells to leukocytes. Using RT-PCR, we detected sHDV RNA also in the liver and blood of the two snakes and could show sHDV infection not only in two of their juvenile offspring, but also in a water python (Liasis mackloti savuensis) in the same snake colony, indicating potentially vertical and horizontal transmission. The finding of abundant sHDAg in several tissues suggests that sHDV actively replicated in the studied animals. Our findings suggest that sHDV spread may not be restricted to hepadnavirus co-infection. This would imply that deltaviruses may employ other enveloped viruses for producing infectious particles.

Hepatitis D virus (HDV) is the only known human satellite virus, and it requires hepatitis B virus (HBV) to form infectious particles. Until 2018 HDV was the sole representative of the genus Deltavirus. The subsequent identification of HDV-like agents in non-human hosts indicated a much longer evolutionary history of deltaviruses than previously hypothesized. Interestingly, none of the HDV-like agents were found in co-infection with an HBV-like agent suggesting that these viruses use different helper virus(es). Here we show, using snake deltavirus (SDeV), that HBV represents only a single example of helper viruses for deltaviruses. We cloned the SDeV genome into a mammalian expression plasmid, and by transfection could initiate SDeV replication in cultured snake and mammalian cells. By superinfecting SDeV infected cells with arenaviruses, or by transfecting different viral surface proteins, we could induce infectious SDeV particle production. Our findings indicate that deltaviruses can likely use a multitude of helper viruses or even viral glycoproteins to form infectious particles. Persistent and recurrent infections would be beneficial for the spread of deltaviruses. It seems plausible that new human and veterinary disease associations with deltavirus infections will be identified in the future.

ABSTRACT Boid inclusion body disease (BIBD) causes losses in captive constrictor snake populations globally. BIBD associates with formation of cytoplasmic inclusion bodies (IB) which mainly comprise reptarenavirus nucleoprotein (NP). In 2017, BIBD was reproduced by cardiac injection of boas and pythons with reptarenaviruses, thus demonstrating a causative link between reptarenavirus infection and the disease. Herein, we report experimental infections of pythons (N=16) and boas (N=16) with three reptarenavirus isolates. First, we used pythons (N=8) to test two virus delivery routes: intraperitoneal injection and tracheal instillation. Independent of the delivery route, we detected viral RNA but no IBs in tissues two weeks post inoculation. Next, we inoculated pythons (N=8) via the trachea. During the four month following the infection snakes showed transient central nervous system (CNS) signs but lacked detectable IB at the time of euthanasia. One of the snakes developed severe CNS signs and we succeeded in re-isolating the virus from the brain of this individual, and could demonstrate viral antigen in neurons. In a third attempt, we tested co-housing, vaccination, and sequential infection with multiple reptarenavirus isolates on boas (N=16). At 10 months post inoculation all except one snake tested positive for viral RNA but none exhibited the characteristic IB. Analysis of the antibody responses demonstrated lower neutralizing but higher anti-reptarenavirus NP titers in experimentally versus naturally reptarenavirus infected boas. Our findings suggest that in addition to reptarenavirus infection, other factors, e.g. the antibody response, contribute to BIBD pathogenesis. IMPORTANCE A 2017 study demonstrated cardiac reptarenavirus injection to induce boid inclusion body disease (BIBD) in pythons and boas. In the present study, we experimentally infected pythons and boas with reptarenavirus via either intraperitoneal injection or tracheal instillation. We found both virus delivery routes to result in infection; though the latter could reflect the natural route of infection. In the experimentally infected snakes, we did not find evidence of inclusion body (IB) formation, characteristic to BIBD, in pythons or in boas. Most of the snakes (11/12) studied were reptarenavirus infected after ten-month follow up, which suggests that they could eventually have developed BIBD. We further found differences between the antibody responses of experimentally and naturally reptarenavirus infected snakes, which could indicate that the pathogenesis of BIBD involves factors additional to reptarenavirus infection. As snakes are poikilotherm, also the housing conditions could have an effect.

SUMMARY The causative agent of the current pandemic and coronavirus disease 2019 (COVID-19) is the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) 1 . Understanding how SARS-CoV-2 enters and spreads within human organs is crucial for developing strategies to prevent viral dissemination. For many viruses, tissue tropism is determined by the availability of virus receptors on the surface of host cells 2 . Both SARS-CoV and SARS-CoV-2 use angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) as a host receptor, yet, their tropisms differ 3-5 . Here, we found that the cellular receptor neuropilin-1 (NRP1), known to bind furin-cleaved substrates, significantly potentiates SARS-CoV-2 infectivity, which was inhibited by a monoclonal blocking antibody against the extracellular b1b2 domain of NRP1. NRP1 is abundantly expressed in the respiratory and olfactory epithelium, with highest expression in endothelial cells and in the epithelial cells facing the nasal cavity. Neuropathological analysis of human COVID-19 autopsies revealed SARS-CoV-2 infected NRP1-positive cells in the olfactory epithelium and bulb. In the olfactory bulb infection was detected particularly within NRP1-positive endothelial cells of small capillaries and medium-sized vessels. Studies in mice demonstrated, after intranasal application, NRP1-mediated transport of virus-sized particles into the central nervous system. Thus, NRP1 could explain the enhanced tropism and spreading of SARS-CoV-2.

ABSTRACT Boid inclusion body disease (BIBD) caused by reptarenaviruses affects collections of captive constrictor snakes worldwide. The disease manifests by formation of cytoplasmic inclusion bodies (IBs) in various tissues. Curiously, a snake with BIBD most often carries more than a single pair of genetically distinct reptarenavirus S and L segments, and the tissues of an infected individual can show variation in the variety of different S and L segment species. The role of reptarenavirus coinfection in development of BIBD remains unknown, and it is unclear how the infection affects the susceptibility to reptarenavirus superinfection or to secondary infection by other agents. Because cell culture studies with mammarenaviruses have demonstrated persistently infected cultures to resist superinfection by genetically similar viruses, we hypothesized that coinfection would only occur if the infecting viruses were of two different species. To study the hypothesis, we employed boa constrictor kidney- and brain-derived cell cultures to perform a set of co- and superinfection experiments with five reptarenavirus and one hartmanivirus isolates. Analysis of viral RNA released from coinfected cells using qRT-PCR did not demonstrate evident competition between reptarenaviruses of the same or different species in the boa constrictor kidney-derived cell line. The experiments on the brain-derived cell line revealed considerable differences in the replication ability of the reptarenaviruses tested, suggesting varying tissue specificity or target cell spectra for reptarenavirus species. Finally, experiments on persistently reptarenavirus infected cell lines showed reduced replication of closely related reptarenaviruses while the replication of reptarenaviruses from different species appeared unaffected. IMPORTANCE Snakes with boid inclusion body disease (BIBD) often display reptarenavirus coinfections, or presence of unbalanced S and L segment ratios. Studies on mammarenaviruses suggest replication interference between closely but not between more distantly related viruses. In the study, we provide evidence that similar interference or competition between segments occurs also in the case of reptarenaviruses. Conversely, the results show that there is very little or no competition between more distantly related L or S segments, the cells release similar amounts of viral RNA segments in the case of mono and coinfection. Successful superinfections of persistently infected cell cultures suggest that the unbalanced S and L segment pools often seen in the infected animals could be a result of segment accumulation through sequential reptarenavirus co- and superinfections during breeding in captivity.

Abstract The recent discovery of Hepatitis D (HDV) -like viruses across a wide range of taxa led to the establishment of the Kolmioviridae family. Recent studies suggest that kolmiovirids can be satellites of viruses other than Hepatitis B virus (HBV), challenging the strict HBV/HDV-association dogma. Studying whether kolmiovirids are able to replicate in any animal cell they enter is essential to assess their zoonotic potential. Here, we compared replication of three kolmiovirids: HDV, rodent (RDeV) and snake deltavirus (SDeV) in vitro and in vivo . We show that SDeV has the narrowest and RDeV the broadest host cell range. High resolution imaging of infected cells revealed nuclear viral hubs with a peculiar RNA-protein organization. Finally, in vivo hydrodynamic delivery of infectious clones showed that both HDV and RDeV, but not SDeV, efficiently replicate in mouse liver, forming massive nuclear viral hubs. Our comparative analysis lays the foundation for the discovery of specific host factors controlling Kolmioviridae host-shifting.

Boid Inclusion Body Disease (BIBD) is a transmissible viral disease of captive snakes that causes severe losses in snake collections worldwide. It is caused by reptarenavirus infection, which can persist over several years without overt signs, but is generally associated with the eventual death of the affected snakes. Thus far, reports have confirmed existence of reptarenaviruses in captive snakes in North America, Europe, and Australia, but there is no evidence that it also occurs in wild snakes. BIBD affects both boas and pythons, the habitats of which do not naturally overlap. Herein, we studied Brazilian captive snakes with BIBD using a metatranscriptomic approach, and report the identification of novel reptarenaviruses, hartmaniviruses, and a new species in the family Chuviridae. The reptarenavirus L segments identified represent six novel species, while we only found a single novel reptarenavirus S segment. Until now, hartmaniviruses had been identified only in European captive boas with BIBD, and the present results increase the number of known hartmanivirus species from four to six. The newly identified chuvirus showed 38.4%, 40.9%, and 48.1% amino acid identity to the nucleoprotein, glycoprotein, and RNA-dependent RNA polymerase of its closest relative, Guangdong red-banded snake chuvirus-like virus. Although we cannot rule out the possibility that the found viruses originated from imported snakes, the results suggest that the viruses would circulate in indigenous snake populations.

ABSTRACT Human hepatitis D virus (HDV), discovered in 1977, represented the sole known deltavirus for decades. The dependence on hepatitis B virus (HBV) co-infection and its glycoproteins for infectious particle formation led to the assumption that deltaviruses are human-only pathogens. However, since 2018, several reports have described identification of HDV-like agents from various hosts but without co-infecting hepadnaviruses. Indeed, we demonstrated that Swiss snake colony virus 1 (SwSCV-1) uses arenaviruses as the helper for infectious particle formation, thus shaking the dogmatic alliance with hepadnaviruses for completing deltavirus life cycle. In vitro systems enabling helper virus-independent replication are key for studying the newly discovered deltaviruses. Others and we have successfully used constructs containing multimers of the deltavirus genome for the replication of various deltaviruses via transfection in cell culture. Here, we report the establishment of deltavirus infectious clones with 1.2× genome inserts bearing two copies of the genomic and antigenomic ribozymes. We used SwSCV-1 as the model to compare the ability of the previously reported “2× genome” and the “1.2× genome” plasmid constructs/infectious clones to initiate replication in cell culture. Using immunofluorescence, qRT-PCR, immuno- and northern blotting, we found the 2× and 1.2× genome clones to similarly initiate deltavirus replication in vitro and both induced a persistent infection of snake cells. We hypothesize that duplicating the ribozymes facilitates the cleavage of genome multimers into unit-length pieces during the initial round of replication. The 1.2× genome constructs enable easier introduction of modifications required for studying deltavirus replication and cellular interactions. IMPORTANCE Hepatitis D virus (HDV) is a satellite virus infecting humans with strict association to hepatitis B virus (HBV) co-infection because HBV glycoproteins can mediate infectious HDV particle formation. For decades, HDV was the sole representative of deltaviruses, which had led to hypotheses suggesting that it evolved in humans, the only known natural host. Recent sequencing studies have led to the discovery of HDV-like sequences across a wide range of species, representing a paradigm shift in deltavirus evolution. Molecular biology tools such as infectious clones, which enable initiation of deltavirus infection without helper virus, are key to demonstrate that the recently found deltaviruses are capable of independent replication. Such tools will enable identification of the potential helper viruses. Here, we report a 1.2× genome copy strategy for designing plasmid-based infectious clones to study deltaviruses and to demonstrate that plasmid delivery into cultured snake cells sufficiently initiates replication of different deltaviruses.