The Contaminant Repository for Affinity Purification (CRAPome) is a database of annotated negative control-data that can be used for filtering out nonspecific interactions in affinity purification-mass spectrometry experiments. Affinity purification coupled with mass spectrometry (AP-MS) is a widely used approach for the identification of protein-protein interactions. However, for any given protein of interest, determining which of the identified polypeptides represent bona fide interactors versus those that are background contaminants (for example, proteins that interact with the solid-phase support, affinity reagent or epitope tag) is a challenging task. The standard approach is to identify nonspecific interactions using one or more negative-control purifications, but many small-scale AP-MS studies do not capture a complete, accurate background protein set when available controls are limited. Fortunately, negative controls are largely bait independent. Hence, aggregating negative controls from multiple AP-MS studies can increase coverage and improve the characterization of background associated with a given experimental protocol. Here we present the contaminant repository for affinity purification (the CRAPome) and describe its use for scoring protein-protein interactions. The repository (currently available for Homo sapiens and Saccharomyces cerevisiae) and computational tools are freely accessible at http://www.crapome.org/ .

The multisubunit eukaryotic translation initiation factor (eIF) 4F recruits 40S ribosomal subunits to the 5' end of mRNA. The eIF4F subunit eIF4E interacts directly with the mRNA 5' cap structure. Assembly of the eIF4F complex is inhibited by a family of repressor polypeptides, the eIF4E-binding proteins (4E-BPs). Binding of the 4E-BPs to eIF4E is regulated by phosphorylation: Hypophosphorylated 4E-BP isoforms interact strongly with eIF4E, whereas hyperphosphorylated isoforms do not. 4E-BP1 is hypophosphorylated in quiescent cells, but is hyperphosphorylated on multiple sites following exposure to a variety of extracellular stimuli. The PI3-kinase/Akt pathway and the kinase FRAP/mTOR signal to 4E-BP1. FRAP/mTOR has been reported to phosphorylate 4E-BP1 directly in vitro. However, it is not known if FRAP/mTOR is responsible for the phosphorylation of all 4E-BP1 sites, nor which sites must be phosphorylated to release 4E-BP1 from eIF4E. To address these questions, a recombinant FRAP/mTOR protein and a FRAP/mTOR immunoprecipitate were utilized in in vitro kinase assays to phosphorylate 4E-BP1. Phosphopeptide mapping of the in vitro-labeled protein yielded two 4E-BP1 phosphopeptides that comigrated with phosphopeptides produced in vivo. Mass spectrometry analysis indicated that these peptides contain phosphorylated Thr-37 and Thr-46. Thr-37 and Thr-46 are efficiently phosphorylated in vitro by FRAP/mTOR when 4E-BP1 is bound to eIF4E. However, phosphorylation at these sites was not associated with a loss of eIF4E binding. Phosphorylated Thr-37 and Thr-46 are detected in all phosphorylated in vivo 4E-BP1 isoforms, including those that interact with eIF4E. Finally, mutational analysis demonstrated that phosphorylation of Thr-37/Thr-46 is required for subsequent phosphorylation of several carboxy-terminal serum-sensitive sites. Taken together, our results suggest that 4E-BP1 phosphorylation by FRAP/mTOR on Thr-37 and Thr-46 is a priming event for subsequent phosphorylation of the carboxy-terminal serum-sensitive sites.

INTRODUCTION Genetic interactions occur when mutations in two or more genes combine to generate an unexpected phenotype. An extreme negative or synthetic lethal genetic interaction occurs when two mutations, neither lethal individually, combine to cause cell death. Conversely, positive genetic interactions occur when two mutations produce a phenotype that is less severe than expected. Genetic interactions identify functional relationships between genes and can be harnessed for biological discovery and therapeutic target identification. They may also explain a considerable component of the undiscovered genetics associated with human diseases. Here, we describe construction and analysis of a comprehensive genetic interaction network for a eukaryotic cell. RATIONALE Genome sequencing projects are providing an unprecedented view of genetic variation. However, our ability to interpret genetic information to predict inherited phenotypes remains limited, in large part due to the extensive buffering of genomes, making most individual eukaryotic genes dispensable for life. To explore the extent to which genetic interactions reveal cellular function and contribute to complex phenotypes, and to discover the general principles of genetic networks, we used automated yeast genetics to construct a global genetic interaction network. RESULTS We tested most of the ~6000 genes in the yeast Saccharomyces cerevisiae for all possible pairwise genetic interactions, identifying nearly 1 million interactions, including ~550,000 negative and ~350,000 positive interactions, spanning ~90% of all yeast genes. Essential genes were network hubs, displaying five times as many interactions as nonessential genes. The set of genetic interactions or the genetic interaction profile for a gene provides a quantitative measure of function, and a global network based on genetic interaction profile similarity revealed a hierarchy of modules reflecting the functional architecture of a cell. Negative interactions connected functionally related genes, mapped core bioprocesses, and identified pleiotropic genes, whereas positive interactions often mapped general regulatory connections associated with defects in cell cycle progression or cellular proteostasis. Importantly, the global network illustrates how coherent sets of negative or positive genetic interactions connect protein complex and pathways to map a functional wiring diagram of the cell. CONCLUSION A global genetic interaction network highlights the functional organization of a cell and provides a resource for predicting gene and pathway function. This network emphasizes the prevalence of genetic interactions and their potential to compound phenotypes associated with single mutations. Negative genetic interactions tend to connect functionally related genes and thus may be predicted using alternative functional information. Although less functionally informative, positive interactions may provide insights into general mechanisms of genetic suppression or resiliency. We anticipate that the ordered topology of the global genetic network, in which genetic interactions connect coherently within and between protein complexes and pathways, may be exploited to decipher genotype-to-phenotype relationships. A global network of genetic interaction profile similarities. ( Left ) Genes with similar genetic interaction profiles are connected in a global network, such that genes exhibiting more similar profiles are located closer to each other, whereas genes with less similar profiles are positioned farther apart. ( Right ) Spatial analysis of functional enrichment was used to identify and color network regions enriched for similar Gene Ontology bioprocess terms.

In most instances, translation is regulated at the initiation phase, when a ribosome is recruited to the 5′ end of an mRNA. The eIF4E-binding proteins (4E-BPs) interdict translation initiation by binding to the translation factor eIF4E, and preventing recruitment of the translation machinery to mRNA. The 4E-BPs inhibit translation in a reversible manner. Hypophosphorylated 4E-BPs interact avidly with eIF4E, whereas 4E-BP hyperphosphorylation, elicited by stimulation of cells with hormones, cytokines, or growth factors, results in an abrogation of eIF4E-binding activity. We reported previously that phosphorylation of 4E-BP1 on Thr 37 and Thr 46 is relatively insensitive to serum deprivation and rapamycin treatment, and that phosphorylation of these residues is required for the subsequent phosphorylation of a set of unidentified serum-responsive sites. Here, using mass spectrometry, we identify the serum-responsive, rapamycin-sensitive sites as Ser 65 and Thr 70. Utilizing a novel combination of two-dimensional isoelectric focusing/SDS-PAGE and Western blotting with phosphospecific antibodies, we also establish the order of 4E-BP1 phosphorylation in vivo; phosphorylation of Thr 37/Thr 46 is followed by Thr 70 phosphorylation, and Ser 65 is phosphorylated last. Finally, we show that phosphorylation of Ser 65 and Thr 70 alone is insufficient to block binding to eIF4E, indicating that a combination of phosphorylation events is necessary to dissociate 4E-BP1 from eIF4E.

Article8 June 2006free access The mTOR/PI3K and MAPK pathways converge on eIF4B to control its phosphorylation and activity David Shahbazian David Shahbazian Department of Biochemistry, McGill Cancer Centre, McGill University, Montreal, Quebec, Canada Search for more papers by this author Philippe P Roux Philippe P Roux Department of Cell Biology, Harvard Medical School, Boston, MA, USA Search for more papers by this author Virginie Mieulet Virginie Mieulet INSERM, Avenir, U584, Université Paris 5, Faculté de Médecine Necker-Enfants Malades, Paris, France Search for more papers by this author Michael S Cohen Michael S Cohen Department of Cellular and Molecular Pharmacology, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Brian Raught Brian Raught Ontario Cancer Institute and McLaughlin Centre for Molecular Medicine, MaRS Centre, Toronto, Ontario, Canada Search for more papers by this author Jack Taunton Jack Taunton Department of Cellular and Molecular Pharmacology, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author John WB Hershey John WB Hershey Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Davis, CA, USA Search for more papers by this author John Blenis John Blenis Department of Cell Biology, Harvard Medical School, Boston, MA, USA Search for more papers by this author Mario Pende Mario Pende INSERM, Avenir, U584, Université Paris 5, Faculté de Médecine Necker-Enfants Malades, Paris, France Search for more papers by this author Nahum Sonenberg Corresponding Author Nahum Sonenberg Department of Biochemistry, McGill Cancer Centre, McGill University, Montreal, Quebec, Canada Search for more papers by this author David Shahbazian David Shahbazian Department of Biochemistry, McGill Cancer Centre, McGill University, Montreal, Quebec, Canada Search for more papers by this author Philippe P Roux Philippe P Roux Department of Cell Biology, Harvard Medical School, Boston, MA, USA Search for more papers by this author Virginie Mieulet Virginie Mieulet INSERM, Avenir, U584, Université Paris 5, Faculté de Médecine Necker-Enfants Malades, Paris, France Search for more papers by this author Michael S Cohen Michael S Cohen Department of Cellular and Molecular Pharmacology, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Brian Raught Brian Raught Ontario Cancer Institute and McLaughlin Centre for Molecular Medicine, MaRS Centre, Toronto, Ontario, Canada Search for more papers by this author Jack Taunton Jack Taunton Department of Cellular and Molecular Pharmacology, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author John WB Hershey John WB Hershey Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Davis, CA, USA Search for more papers by this author John Blenis John Blenis Department of Cell Biology, Harvard Medical School, Boston, MA, USA Search for more papers by this author Mario Pende Mario Pende INSERM, Avenir, U584, Université Paris 5, Faculté de Médecine Necker-Enfants Malades, Paris, France Search for more papers by this author Nahum Sonenberg Corresponding Author Nahum Sonenberg Department of Biochemistry, McGill Cancer Centre, McGill University, Montreal, Quebec, Canada Search for more papers by this author Author Information David Shahbazian1, Philippe P Roux2, Virginie Mieulet3, Michael S Cohen4, Brian Raught5, Jack Taunton4, John WB Hershey6, John Blenis2, Mario Pende3 and Nahum Sonenberg 1 1Department of Biochemistry, McGill Cancer Centre, McGill University, Montreal, Quebec, Canada 2Department of Cell Biology, Harvard Medical School, Boston, MA, USA 3INSERM, Avenir, U584, Université Paris 5, Faculté de Médecine Necker-Enfants Malades, Paris, France 4Department of Cellular and Molecular Pharmacology, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA 5Ontario Cancer Institute and McLaughlin Centre for Molecular Medicine, MaRS Centre, Toronto, Ontario, Canada 6Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Davis, CA, USA *Corresponding author. Department of Biochemistry, McGill University, McIntyre Medical Sciences Building, 3655 Promenade Sir-William-Osler, Rm. 807, Montreal, Quebec, Canada H3G 1Y6. Tel.: +1 514 398 7274; Fax: +1 514 398 1287; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2006)25:2781-2791https://doi.org/10.1038/sj.emboj.7601166 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info The eukaryotic translation initiation factor 4B (eIF4B) plays a critical role in recruiting the 40S ribosomal subunit to the mRNA. In response to insulin, eIF4B is phosphorylated on Ser422 by S6K in a rapamycin-sensitive manner. Here we demonstrate that the p90 ribosomal protein S6 kinase (RSK) phosphorylates eIF4B on the same residue. The relative contribution of the RSK and S6K modules to the phosphorylation of eIF4B is growth factor-dependent, and the two phosphorylation events exhibit very different kinetics. The S6K and RSK proteins are members of the AGC protein kinase family, and require PDK1 phosphorylation for activation. Consistent with this requirement, phosphorylation of eIF4B Ser422 is abrogated in PDK1 null embryonic stem cells. Phosphorylation of eIF4B on Ser422 by RSK and S6K is physiologically significant, as it increases the interaction of eIF4B with the eukaryotic translation initiation factor 3. Introduction Translation initiation is the step at which the ribosome is recruited to the mRNA (Gingras et al, 1999; Hershey and Merrick, 2000). Multiple eukaryotic initiation factors (eIFs) are involved in this process. The heterotrimeric eIF4F consists of the cap-binding protein eIF4E, the scaffolding protein eIF4G, and the helicase eIF4A. eIF4F, through eIF4E, recognizes the mRNA 5′ cap structure. The eIF4A subunit is thought to unwind secondary structure in the mRNA 5′UTR to facilitate ribosome binding. The eukaryotic translation initiation factor 4B (eIF4B) stimulates eIF4F activity by potentiating the eIF4A RNA helicase activity (e.g. (Rozen et al, 1990; for reviews see (Gingras et al, 1999; Hershey and Merrick, 2000). eIF4G bridges the mRNA with the ribosome through its interaction with the eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) (Etchison et al, 1982), which was demonstrated to interact directly with eIF4B (Methot et al, 1996; Vornlocher et al, 1999). Initiation is a critical step and a checkpoint of translation. Translational control is exerted by many different types of extracellular stimuli, which activate various signaling pathways and nutrient-sensing modules (Raught et al, 2000). Signaling pathways regulate the activities of components of the translational machinery and stimulate ribosome biogenesis to coordinate the translational capacity of the cell with nutrient availability and mitogenic cues (Holland et al, 2004; Avruch et al, 2005). Two well-studied pathways that exhibit a paramount effect on translational regulation are the Ras–MAPK and PI3K/Akt/mTOR signaling modules. Ras, through Raf, activates the dual threonine/tyrosine kinase MAPKKs, MEK1/2, which in turn phosphorylate and activate the ERK1/2 protein kinases, resulting in phosphorylation of multiple cytoplasmic (e.g. ribosomal protein S6 kinase (RSK), Mnk1/2) and nuclear (e.g. transcription factors) substrates (Roux and Blenis, 2004). PI3K phosphorylates the membrane-bound phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate at position 3 to produce phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PIP3). PIP3 serves as a membrane docking signal for PH domain-containing proteins such as the serine/threonine kinases Akt/PKB and PDK1 (phosphatidylinositol-dependent kinase 1). PDK1 activates Akt/PKB by phosphorylating Thr308 (in Akt1) within the T-loop of the catalytic domain (Alessi et al, 1996). PDK1 also phosphorylates the homologous site in multiple AGC family kinases (Williams et al, 2000). Among these are the different isoforms of S6K and RSK. The highly homologous S6K1 and S6K2 proteins (>80% identity) are encoded by distinct genes. Both S6K1 and S6K2 are phosphorylated and activated in a rapamycin-sensitive manner by mTOR, which phosphorylates a threonine residue in the linker domain (Burnett et al, 1998; Volarevic and Thomas, 2001; Park et al, 2002), allowing phosphorylation by PDK1 in the catalytic domain (Alessi et al, 1998; Balendran et al, 1999). The RSK family consists of four members (RSK1–4) (Blenis, 1993; Roux and Blenis, 2004). Activation of the RSKs requires coordinated input from the Ras/MAPK cascade (Blenis, 1993) and PDK1 (Jensen et al, 1999). The RSKs are involved in multiple processes in the cell, including transcriptional regulation, cell cycle control, protein synthesis, and feedback inhibition of the Ras/MAPK cascade via Sos phosphorylation (reviewed in Roux and Blenis, 2004). Here we identify RSK as an in vivo and in vitro eIF4B Ser422 kinase. Results Rapamycin-resistant eIF4B Ser422 phosphorylation is mediated by ERK1/2 MAPK signaling Insulin-stimulated eIF4B phosphorylation at Ser422 was previously demonstrated to be rapamycin-sensitive, and the kinase responsible for Ser422 phosphorylation was identified as S6K (Raught et al, 2004; see also Figure 1A, compare lanes 9 and 10, upper panel). Interestingly, however, when HeLa cells are stimulated with serum, a significant fraction of Ser422 phosphorylation remains resistant to inhibition by rapamycin (Figure 1A, compare lane 6 to 5, upper panel). Figure 1.Rapamycin-resistant eIF4B Ser422 phosphorylation is mediated by ERK1/2 MAPK signaling. (A) HeLa cells were deprived of serum in the presence or absence of 20 nM rapamycin for 16–18 h. Cells were pretreated with 10 μM of U0126 for 2 h, and then stimulated with either 20% serum or insulin (100 nM) for 30 min. Total cell extracts were subjected to SDS–PAGE followed by immunoblotting with phospho-eIF4B S422, phospho-S6K1 T389, and phospho-ERK1/2 T202/Y204 antibodies and the membrane was reprobed with anti-eIF4B antiserum. (B) HeLa cells were starved for serum as in (A) and stimulated for the indicated times with either 20% serum or insulin (100 nM). Cell extracts were resolved by SDS–PAGE and immunoblotted with phospho-eIF4G S1108, phospho-eIF4B S422, phospho-S6K1 T389, phospho-ERK1/2 T202/Y204, phospho-S6 S240/244 antibodies and the indicated total proteins. (C) HeLa cells were deprived of serum in the presence or absence of 20 nM rapamycin for 16–18 h. Cells were pretreated with 10 μM of U0126 for 2 h, and then stimulated with 20% serum for the indicated times. Total cell extracts were resolved by SDS–PAGE, immunoblotted with phospho-eIF4G S1108, phospho-eIF4B S422, phospho-S6K1 T389, phospho-ERK1/2 T202/Y204, and phospho-S6 S240/244 antibodies and reprobed for the indicated proteins with pan-specific antibodies. (D) Sequential activation of signaling pathways involved in eIF4B Ser422 phosphorylation. HeLa cells were deprived of serum for 16–18 h. Cells were then stimulated with 20% serum for the indicated amounts of time. Protein extracts were resolved by SDS–PAGE and probed for phospho-eIF4B S422, phospho-ERK1/2 T202/Y204, and phospho-S6K T389. Download figure Download PowerPoint In addition to the mTOR/PI3K pathway, the MAPK signaling module appears to play an important role in translational control (Rajasekhar et al, 2003; Naegele and Morley, 2004). It was thus pertinent to examine the contribution of this pathway to eIF4B phosphorylation. To determine whether the MAPK cascade is responsible for rapamycin-resistant eIF4B Ser422 phosphorylation, cells were treated with the MEK1/2/5 inhibitor U0126 (Duncia et al, 1998) before serum or insulin stimulation. To monitor for the efficiency of rapamycin and U0126 treatments, immunoblotting assays using phosphospecific antibodies raised against phosphorylated Thr389 of S6K, or active ERK1/2 (dually phosphorylated on Thr202 and Tyr204) were also carried out (Figure 1A). A rapamycin-resistant component of eIF4B Ser422 phosphorylation is observed in serum-stimulated but not in insulin-stimulated cells (compare lanes 6 and 10). This residual phosphorylation is abrogated by U0126 treatment (compare lanes 6 and 8). U0126 by itself has a minor effect on eIF4B phosphorylation in serum-stimulated cells, and no effect in insulin-stimulated cells, consistent with the lack of ERK activation by insulin (lanes 7 and 11, respectively). Total eIF4B protein levels were not affected by any of the treatments, as determined by reprobing the membrane with pan-eIF4B antibody. Thus, rapamycin-resistant phosphorylation of eIF4B Ser422 phosphorylation is mediated by ERK1/2 MAPK signaling. Experiments using specific inhibitors of p38 (SB203580) and JNK1/2 (JNK inhibitor II) ruled out an involvement of these MAP kinases in Ser422 phosphorylation, as these inhibitors failed to reduce serum-stimulated phosphorylation of Ser422 in rapamycin-pretreated cells (data not shown). To study the differential sensitivity of eIF4B phosphorylation to rapamycin and U0126, a time-course experiment was carried out (Figure 1B). Both serum and insulin stimulated the phosphorylation of the PI3K/Akt/mTOR pathway substrates, eIF4G (Ser1108) and S6K1 (Thr389), with similar kinetics, although the insulin-induced S6K phosphorylation is somewhat delayed and less intense (compare lanes 4 and 10). A phosphorylation time course of the S6K substrates rpS6 (Ser240/244) and eIF4B (Ser422) is similar in insulin-stimulated cells. However, in serum-induced cells, eIF4B Ser422 phosphorylation appears faster than S6 phosphorylation (Figure 1B, lanes 9–12), and is detectable before S6K activation (compare lanes 3 and 9). Importantly, in contrast to serum, insulin is incapable of activating the MAPK ERK1/2 cascade in these cells (lanes 1–6). The inability of insulin to effect signaling through the MAPK module is the most likely explanation for the complete rapamycin sensitivity of eIF4B phosphorylation in insulin-stimulated cells. To further characterize the biphasic pattern of eIF4B phosphorylation, a time-course experiment using serum in the presence or absence of U0126 or rapamycin was performed (Figure 1C). Activation of the MAPK cascade was monitored by immunoblotting with phosphospecific antibodies directed against activated ERK1/2. Cell extracts were also examined for phosphorylation of the rapamycin-sensitive substrates eIF4G and S6K1, using phosphospecific antibodies, and 4E-BP1 using a pan-specific antibody. Serum-induced MAPK phosphorylation is very rapid, detected as early as 3 min after serum stimulation, and reaches a peak at 5 min post-induction (Figure 1C). In contrast, S6K phosphorylation and activity (as determined by rpS6 Ser240/244 phosphorylation) are undetectable at these early time points, but are sustained for much longer (compare 60 and 90 min). These data demonstrate that eIF4B phosphorylation in response to serum is mediated by both the MAPK and PI3K/mTOR pathways. Importantly, eIF4B phosphorylation can be temporally divided into two phases: an early phase, which is sensitive to U0126, but not to rapamycin (compare the 15 min time points with the two inhibitors, lanes 10 and 16), and a late phase, which is inhibited by rapamycin (compare 60 and 90 min, lanes 11 and 12 versus 17 and 18). Simultaneous treatment of cells with both inhibitors abrogates eIF4B phosphorylation at all times (lanes 20–24). A detailed time-course experiment (Figure 1D) clearly demonstrates that serum-induced eIF4B phosphorylation is detectable before the activation of S6K (as judged by S6K1 T389 and rpS6 S240/244 phosphorylation). eIF4B Ser422 phosphorylation persists in cells lacking S6K1 and S6K2 To further corroborate the existence of an eIF4B kinase that is distinct from S6K in cells other than HeLa, primary hepatocyte cultures from S6K1/2−/− double knockout (DKO) mice were used. The extent of eIF4B phosphorylation was similar in wild-type (wt) and S6K-deficient hepatocytes under serum-deprived conditions, and upon insulin or serum stimulation (Figure 2A). However, the wt and mutant cells differed in their sensitivity to rapamycin. Whereas rapamycin abrogated eIF4B phosphorylation following insulin stimulation, and partially after serum stimulation in wt cells, Ser422 phosphorylation was completely resistant to rapamycin treatment in S6K DKO hepatocytes. Thus, S6K phosphorylates eIF4B in insulin-stimulated hepatocytes, but an mTOR-independent kinase efficiently compensates for the S6K deletion. Consistent with the data in HeLa cells, serum activates an mTOR-independent mechanism that leads to phosphorylation of eIF4B in wt and S6K-deficient hepatocytes. Figure 2.(A) eIF4B Ser422 phosphorylation persists in cells lacking S6K1 and S6K2. Hepatocytes derived from wt and S6K1/2 DKO animals were starved for nutrients and serum and stimulated with 1 μM insulin or 10% serum in the presence or absence of 20 nM rapamycin. Total cell lysates were immunoblotted with phospho-eIF4B S422, phospho-S6 S235/236, phospho-S6K1 T389, and rpL7 antibodies. (B) Substrate consensus sequences of S6K and RSK as compared to the eIF4B fragment encompassing the Ser422 phosphorylation site. Download figure Download PowerPoint The amino-terminal kinase domain of the RSKs shares a high degree of homology with the S6K proteins, and the consensus phosphorylation sequence recognized by RSK1 (and presumably the highly homologous RSK2–4 isoforms) is almost identical to that of the S6K proteins (Leighton et al, 1995). Unlike S6K, which is activated by PDK1 (Alessi et al, 1998) and mTOR (Burnett et al, 1998), RSK activity is regulated by the ERK1/2 MAPKs (Frodin and Gammeltoft, 1999; Frodin et al, 2000) and PDK1 (Jensen et al, 1999). As the amino-acid sequence surrounding eIF4B Ser422 conforms to both the RSK and S6K consensus sequences (Figure 2B), and the RSKs are regulated by the ERK MAPKs, the RSKs appear to be the most likely candidates to effect the MAPK-dependent rapamycin-resistant phosphorylation of Ser422. Ser422 is dephosphorylated in PDK1 null and PIF pocket mutant ES cells Members of the AGC family of kinases are phosphorylated by PDK1 on the T-loop; this phosphorylation event is required for their full activation. PDK1 null cells are defective for both RSK and S6K activation (Mora et al, 2004). To determine whether Ser422 phosphorylation is affected in these cells, wt and PDK1 KO embryonic stem (ES) cells were serum starved for 16 h in the presence or absence of rapamycin, and then stimulated with serum for 15 min. Consistent with previously published data (Williams et al, 2000), phosphorylation of S6K T389 and rpS6 S240/244 is abrogated in PDK1 null cells (Figure 3A, lanes 5–8). Unlike their wt counterparts, PDK1 null ES cells exhibit no detectable eIF4B kinase activity upon serum stimulation (lanes 5–8). Similar to the data shown for HeLa cells (Figure 1C, lanes 4 and 10), rapamycin did not abrogate serum-induced eIF4B phosphorylation in wt ES cells (compare lane 4 to 3). Figure 3.eIF4B Ser422 is dephosphorylated in PDK1 null and PDK1 PIF pocket mutant ES cells. Wt and PDK1−/− knockout (A) or PDK1 PIF pocket mutant (B) ES cells were starved for 16–18 h in the presence or absence of 20 nM rapamycin and then stimulated with 20% serum for 15 min. Total cell extracts were resolved by SDS–PAGE and proteins were detected by immunoblotting using phospho-eIF4B S422, phospho-S6K1 T389, phospho-S6 S240/244, and phospho-ERK1/2 T202/Y204 antibodies. Membranes were reprobed with antibodies against the indicated total proteins and against PDK1 (arrows on the right indicate nonspecific bands). Download figure Download PowerPoint Another member of the AGC family that phosphorylates a consensus sequence similar to that of the RSKs and S6Ks is Akt (Obata et al, 2000). Mutation of Leu155 to glutamate in the PDK1 substrate docking site, also known as the ‘PIF pocket’ (for PDK1 interacting fragment), prevents PDK1 from interacting with and phosphorylating S6K and RSK, but does not affect its ability to activate Akt (Biondi et al, 2001; Collins et al, 2003). To determine whether Akt is able to phosphorylate eIF4B, we studied Ser422 phosphorylation in PDK1 PIF pocket mutant knock-in ES cells. Similar to PDK1 null cells, PDK1 PIF pocket mutant cells are devoid of Ser422 kinase activity (Figure 3B, compare lanes 5–8 to 1–4). These data, although consistent with the idea that both S6K and RSK are bona fide eIF4B kinases, do not completely rule out the participation of other AGC kinases in eIF4B phosphorylation. However, given that eIF4B phosphorylation is sensitive to pharmacological inhibitors that fail to inhibit other AGC kinases, it is very likely that the major kinases responsible for eIF4B phosphorylation are S6K and RSK. Catalytically active RSK variants phosphorylate eIF4B in vitro and in vivo To demonstrate that RSK can directly phosphorylate eIF4B, we examined eIF4B phosphorylation in an in vitro kinase assay. HeLa cells were transfected with plasmids encoding HA-tagged wt RSK1 and S6K1, as well as a kinase-inactive RSK1 mutant. Cells were serum starved for 16–18 h, and pretreated with U0126 or rapamycin before serum or insulin stimulation (Figure 4A). Immunocomplex kinase assays were then carried out with recombinant eIF4B as a substrate in vitro. Wt (but not kinase-dead) RSK elicited a 3.5-fold increase in eIF4B phosphorylation (Figure 4A), indicating that RSK, but not a co-purifying kinase activity, is responsible for the phosphorylation. Pretreatment of cells with U0126 abrogated RSK-mediated eIF4B phosphorylation in vitro. S6K immunoprecipitated from insulin-treated cells exhibited a five-fold increase in eIF4B phosphorylation relative to basal phosphorylation levels (an unstimulated sample expressing HA-S6K1). This phosphorylation was abrogated by rapamycin pretreatment (Figure 4A). Figure 4.Catalytically active RSK variants phosphorylate eIF4B in vitro and in vivo. (A) Wt and kinase-dead HA-RSK- and wt HA-S6K1-transfected HeLa cells were serum starved for 16–18 h, pretreated with either U0126 (10 μM; U0) or rapamycin (20 nM; RAP) as indicated, and stimulated with either serum or insulin for 15 min. An aliquot of the total cell lysate was immunoblotted for ERK1/2. Another aliquot was used to immunoprecipitate RSK variants and S6K1 using anti-HA antibody. Immunoprecipitates were split. Half was subjected to SDS–PAGE and probed for HA and the remaining half was assayed for in vitro kinase activity by using recombinant eIF4B as substrate. Samples were resolved by SDS–PAGE, stained with Coomassie brilliant blue, and exposed to an X-ray film. 32P incorporation was quantified using a phosphorimager. A representative autoradiogram is shown. (B, C) HeLa cells cotransfected with Flag-tagged eIF4B together with wt, kinase-dead, and constitutively active RSK variants were serum starved for 16–18 h in the presence or absence of 10 μM U0126 (B) or 20 nM rapamycin (C) before serum stimulation for 15 min (B) or 90 min (C). Cell lysates were used to immunoprecipitate exogenous Flag-tagged eIF4B using anti-Flag (M2) antibody. Immune complexes were subjected to SDS–PAGE and probed with antibodies directed against phosphorylated eIF4B Ser422. Membranes were reprobed with anti-Flag antibody. Aliquots of total cell lysates were run on gel and probed with indicated antibodies. (D) HeLa cells were transfected with Flag-eIF4B. After 24 h, cells were deprived of serum in the presence or absence of increasing concentrations of RSK1/2 inhibitor fmk for 16–18 h. Cells were stimulated with 20% serum for 15 min. eIF4B was immunoprecipitated using anti-Flag antibody. Immune complexes were subjected to SDS–PAGE and Western blotting with phospho-eIF4B S422 antibody. The membrane was stripped and reprobed with Flag antibody. (E) HeLa cells were deprived of serum in the presence or absence of 10 μM RSK1/2 inhibitor fmk for 16–18 h. Cells were stimulated with 20% serum for 15 min. Total cell extracts were subjected to SDS–PAGE followed by immunoblotting with phospho-eIF4B S422, phospho-ERK1/2 T202/Y204, phospho-RSK S380, and phospho-S6K1 T389 antibodies and then reprobed for total eIF4B and ERK1/2. Download figure Download PowerPoint To further demonstrate that RSK can phosphorylate eIF4B in vivo, HeLa cells were cotransfected with various RSK1 mutants and Flag-tagged eIF4B. Cells were stimulated with serum for 15 (Figure 4B) or 90 min (Figure 4C), following pretreatment with U0126 or rapamycin, respectively. Whereas catalytically active wt RSK and MyrRSK (a constitutively active, membrane-targeted form) potently phosphorylated Ser422, the kinase-dead RSK variant not only failed to do so, but actually suppressed serum-induced eIF4B phosphorylation (compare Figure 4B, lane 8 to lanes 2 and 5). Ser422 phosphorylation was readily detectable in unstimulated cells transfected with MyrRSK (Figure 4B and C). This basal phosphorylation was increased after 15 min of serum stimulation, but not when cells were treated with U0126 (Figure 4B). A fraction of the Ser422 phosphorylation induced by MyrRSK is not inhibited by U0126. Consistent with the earlier report, MyrRSK retains some activity even in the presence of MEK inhibitors (Roux et al, 2004). Flag-eIF4B phosphorylation in cells stimulated with serum for 90 min exhibited rapamycin sensitivity, unless coexpressed with MyrRSK (Figure 4C). Additional evidence for an in vivo contribution of RSK to eIF4B phosphorylation was obtained through the use of a recently designed and characterized fluoromethylketone (fmk), which potently and selectively inactivates RSK1 and RSK2 in mammalian cells (Cohen et al, 2005). The inhibitor targets the C-terminal kinase domain of RSK1 and RSK2, preventing autophosphorylation on S380 and S386 of human RSK1 and RSK2, respectively. This phosphorylation enables PDK1 docking, which then phosphorylates and activates the RSK N-terminal kinase domain (Jensen et al, 1999; Frodin et al, 2000). To determine the optimal inhibitory concentration of fmk in HeLa cells, a dose–response experiment was carried out. HeLa cells were transfected with Flag-tagged eIF4B, then deprived of serum in the presence of increasing concentrations of fmk for 16–18 h. Cells were then stimulated with serum for 15 min, and eIF4B was immunoprecipitated using anti-Flag antibody and subjected to SDS–PAGE and Western blotting with the phosphospecific eIF4B Ser422 antibody. Fmk addition resulted in a dose-dependent inhibition of serum-induced eIF4B phosphorylation, reaching a plateau at 3 μM (Figure 4D). To determine whether endogenous eIF4B phosphorylation is also sensitive to fmk treatment, HeLa cells were starved of serum in the presence or absence of 10 μM fmk for 16 h, before serum stimulation for 15 min. Fmk strongly reduced serum-stimulated phosphorylation of eIF4B and RSK1, whereas S6K and MAPK activation remained unaffected (Figure 4E). In conclusion, RSK phosphorylates Ser422 both in vitro and in vivo. The early phase of eIF4B phosphorylation is more dependent on RSK activity than at later times. RNAi of the RSK1 and RSK2 isoforms leads to reduced eIF4B Ser422 phosphorylation and inhibits cap-dependent translation To further substantiate the involvement of RSK in eIF4B Ser422 phosphorylation, HeLa S3 cells were cotransfected with small interfering RNAs (siRNAs) targeting RSK1 and RSK2, or with mock siRNA. The siRNA treatment resulted in a >90% knockdown of both RSK1 and RSK2 expression. At 24 h post-transfection, cells were starved of serum, pretreated with inhibitors, and then stimulated with either serum or insulin for 15 min. Both serum and insulin elicited phosphorylation of eIF4B on Ser422 in mock siRNA-transfected cells (Figure 5A, lanes 2 and 6). As expected, serum-induced phosphorylation of eIF4B was sensitive to U0126 (lanes 2 and 4), whereas insulin-stimulated eIF4B phosphorylation was sensitive to rapamycin (lanes 6 and 7). Serum-induced (compare lanes 2 and 3 to lanes 9 and 10), but not insulin-induced (compare lanes 6 and 13), eIF4B Ser422 phosphorylation was prevented by RNAi directed against RSK1/2. Figure 5.RNAi-mediated silencing of RSK1 and RSK2 isoforms expression leads to reduced eIF4B Ser422 phosphorylation and inhibition of cap-dependent translation. (A) HeLa cells were subjected to RNAi using synthetic oligos nonspecific (Mock) or specific to RSK1 and RSK2 isoforms. At 24 h post-transfection, cells were serum starved for 16–18 h in the presence or absence of rapamycin, then indicated samples were treated with U0126 and stimulated with serum or insulin as shown. Total cell extracts were immunoblotted with phospho-eIF4B S422 and phospho-ERK1/2 T202/Y204 antibodies followed by reprobing for the corresponding total proteins. RSK1 and RSK2 Western blots were also carried out to demonstrate the efficiency of the knockdown. (B) HEK293 cells were transfected with the bicistronic luciferase construct and indicated siRNAs. After 48 h, cells were harvested and assayed for Renilla (RL) and firefly (FL) luminescence. Results are presented as average of RL/FL ratio±standard error from three independent experiments carried out in triplicate. Download figure Download PowerPoint To assess the effect of RSK1/2 RNAi on cap-dependent translation, HEK293 cells were cotransfected with RSK1 and RSK2 targeting siRNAs and bicistronic Renilla-HCV IRES-firefly luciferase reporter (see Figure 5B). After 48 h, cells were harvested and analyzed for luciferase activity. The data suggest that

The centrosome is the primary microtubule organizing center of the cells and templates the formation of cilia, thereby operating at a nexus of critical cellular functions. Here, we use proximity-dependent biotinylation (BioID) to map the centrosome-cilium interface; with 58 bait proteins we generate a protein topology network comprising >7,000 interactions. Analysis of interaction profiles coupled with high resolution phenotypic profiling implicates a number of protein modules in centriole duplication, ciliogenesis, and centriolar satellite biogenesis and highlights extensive interplay between these processes. By monitoring dynamic changes in the centrosome-cilium protein interaction landscape during ciliogenesis, we also identify satellite proteins that support cilia formation. Systematic profiling of proximity interactions combined with functional analysis thus provides a rich resource for better understanding human centrosome and cilia biology. Similar strategies may be applied to other complex biological structures or pathways.

Article8 April 2004free access Phosphorylation of eucaryotic translation initiation factor 4B Ser422 is modulated by S6 kinases Brian Raught Brian Raught Department of Biochemistry and McGill Cancer Centre, McGill University, Montréal, Québec, CanadaPresent address: Institute for Systems Biology, 1441 34th St, Seattle, WA 98103, USA Search for more papers by this author Franck Peiretti Franck Peiretti Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Davis, CA, USA Search for more papers by this author Anne-Claude Gingras Anne-Claude Gingras Department of Biochemistry and McGill Cancer Centre, McGill University, Montréal, Québec, CanadaPresent address: Institute for Systems Biology, 1441 34th St, Seattle, WA 98103, USA Search for more papers by this author Mark Livingstone Mark Livingstone Cell Signaling Technology, Inc., 166B Cummings Center, Beverly, MA, USA Search for more papers by this author David Shahbazian David Shahbazian Department of Biochemistry and McGill Cancer Centre, McGill University, Montréal, Québec, Canada Search for more papers by this author Greg L Mayeur Greg L Mayeur Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Davis, CA, USA Search for more papers by this author Roberto D Polakiewicz Roberto D Polakiewicz Cell Signaling Technology, Inc., 166B Cummings Center, Beverly, MA, USA Search for more papers by this author Nahum Sonenberg Nahum Sonenberg Department of Biochemistry and McGill Cancer Centre, McGill University, Montréal, Québec, Canada Search for more papers by this author John WB Hershey Corresponding Author John WB Hershey Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Davis, CA, USA Search for more papers by this author Brian Raught Brian Raught Department of Biochemistry and McGill Cancer Centre, McGill University, Montréal, Québec, CanadaPresent address: Institute for Systems Biology, 1441 34th St, Seattle, WA 98103, USA Search for more papers by this author Franck Peiretti Franck Peiretti Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Davis, CA, USA Search for more papers by this author Anne-Claude Gingras Anne-Claude Gingras Department of Biochemistry and McGill Cancer Centre, McGill University, Montréal, Québec, CanadaPresent address: Institute for Systems Biology, 1441 34th St, Seattle, WA 98103, USA Search for more papers by this author Mark Livingstone Mark Livingstone Cell Signaling Technology, Inc., 166B Cummings Center, Beverly, MA, USA Search for more papers by this author David Shahbazian David Shahbazian Department of Biochemistry and McGill Cancer Centre, McGill University, Montréal, Québec, Canada Search for more papers by this author Greg L Mayeur Greg L Mayeur Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Davis, CA, USA Search for more papers by this author Roberto D Polakiewicz Roberto D Polakiewicz Cell Signaling Technology, Inc., 166B Cummings Center, Beverly, MA, USA Search for more papers by this author Nahum Sonenberg Nahum Sonenberg Department of Biochemistry and McGill Cancer Centre, McGill University, Montréal, Québec, Canada Search for more papers by this author John WB Hershey Corresponding Author John WB Hershey Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Davis, CA, USA Search for more papers by this author Author Information Brian Raught1,‡, Franck Peiretti2,‡, Anne-Claude Gingras1, Mark Livingstone3, David Shahbazian1, Greg L Mayeur2, Roberto D Polakiewicz3, Nahum Sonenberg1 and John WB Hershey 2 1Department of Biochemistry and McGill Cancer Centre, McGill University, Montréal, Québec, Canada 2Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Davis, CA, USA 3Cell Signaling Technology, Inc., 166B Cummings Center, Beverly, MA, USA ‡These authors contributed equally to this paper *Corresponding author. Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California at Davis, Health Science Drive, Davis, CA 95616, USA. Tel.: +1 530 752 3235; Fax: +1 530 752 3516; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2004)23:1761-1769https://doi.org/10.1038/sj.emboj.7600193 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info The eucaryotic translation initiation factor 4B (eIF4B) stimulates the helicase activity of the DEAD box protein eIF4A to unwind inhibitory secondary structure in the 5′ untranslated region of eucaryotic mRNAs. Here, using phosphopeptide mapping and a phosphospecific antiserum, we identify a serum-responsive eIF4B phosphorylation site, Ser422, located in an RNA-binding region required for eIF4A helicase-promoting activity. Ser422 phosphorylation appears to be regulated by the S6Ks: (a) Ser422 phosphorylation is sensitive to pharmacological inhibitors of phosphoinositide-3 kinase and the mammalian target of rapamycin; (b) S6K1/S6K2 specifically phosphorylate Ser422 in vitro; and (c) rapamycin-resistant S6Ks confer rapamycin resistance upon Ser422 phosphorylation in vivo. Substitution of Ser422 with Ala results in a loss of activity in an in vivo translation assay, indicating that phosphorylation of this site plays an important role in eIF4B function. We therefore propose that eIF4B may mediate some of the effects of the S6Ks on translation. Introduction Translational control is primarily exerted at the initiation phase, a complex process mediated by a number of eucaryotic translation initiation factors (eIFs), during which ribosomes are recruited to the 5′ end of an mRNA and positioned at a start codon (reviewed in Gingras et al, 1999b; Hershey and Merrick, 2000). The mRNA 5′ end is distinguished by the presence of a ‘cap’ structure (m7GpppN, where m is a methyl group and N is any nucleotide), which is specifically bound by the cap-binding protein eIF4E. eIF4E, via an interaction with the large scaffolding protein eIF4G, guides the translation machinery to the 5′ end of mRNA. eIF4E and eIF4G function as components of the dynamic, heterotrimeric eIF4F complex, along with the DEAD box RNA helicase eIF4A. Optimal ribosome binding is thought to require a region of single-stranded mRNA (Gingras et al, 1999b). Thus, it has been proposed that one critical function of eIF4F is to melt cap-proximal inhibitory secondary structure to provide a single-stranded RNA ‘landing pad’ for the 40S ribosomal subunit (Gingras et al, 1999b). eIF4A alone displays only low levels of RNA helicase activity (Rogers et al, 1999), but this activity is significantly stimulated by a cofactor, eucaryotic translation initiation factor 4B (eIF4B) (Lawson et al, 1989). eIF4B is an RNA-binding protein first purified as an activity capable of stimulating translation and promoting ribosome binding to mRNA (Trachsel et al, 1977; Benne and Hershey, 1978). More recent studies utilizing a ribosome toe-printing assay have validated this role (Pestova et al, 1996; Morino et al, 2000). eIF4B possesses no autonomous catalytic activity (Grifo et al, 1984), but enhances the affinity of eIF4A for ATP and mRNA (Rogers et al, 1999), and increases the processivity of the helicase (Rogers et al, 2001). eIF4B is a phosphoprotein that migrates as multiple isoelectric variants in the two-dimensional isoelectric focusing (IEF)/SDS–PAGE system (Duncan and Hershey, 1984). eIF4B hyperphosphorylation, as elicited by mitogens and phorbol esters, correlates with the growth status of the cell (Duncan and Hershey, 1985) and an increase in the translation rates of mRNAs possessing long, structured 5′ untranslated regions (5′UTRs) (Manzella et al, 1991). Importantly, eIF4B is required for the formation of 48S translation initiation complexes in vitro on 5′UTRs with even only moderate amounts of secondary structure (Dmitriev et al, 2003). Interestingly, recombinant eIF4B cannot substitute for purified native eIF4B in this assay (Dmitriev et al, 2003), suggesting that a post-translational modification that occurs only in mammalian cells is important for eIF4B activity. We and others have demonstrated that the activity of several translation regulatory factors is modulated by the phosphoinositide-3 kinase (PI3K) and mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling modules (reviewed in Gingras et al, 1999b; Fumagalli and Thomas, 2000; Raught et al, 2000b; Dennis and Thomas, 2002). The PI3Ks are a family of mitogen-responsive lipid kinases that play a role in many critical cellular processes (reviewed in Cantley, 2002). The TOR proteins are evolutionarily conserved protein kinases thought to function in a nutrient-sensing checkpoint control capacity. Amino-acid deprivation results in a TOR-mediated shift from anabolic to catabolic processes, including alteration in amino-acid transporter expression levels, a dramatic shift in the transcription levels of genes involved in amino-acid utilization, and the activation of autophagy (reviewed in Schmelzle and Hall, 2000; Raught et al, 2001). Inactivation of the TOR proteins, or treatment with an inhibitor of TOR signaling, rapamycin, mimics nutrient deprivation in yeast, Drosophila and mammalian cells (e.g. Barbet et al, 1996; Kimball and Jefferson, 2000, and references therein; Oldham et al, 2000; Zhang et al, 2000). A current model for TOR checkpoint signaling proposes that a permissive signal is relayed to downstream translational targets only in the presence of sufficient nutrients to fuel protein synthesis. In signaling to translation effectors, the TOR proteins appear to function in a coregulatory capacity with other signaling pathways (such as the PI3K signaling module): In this way, a passive nutrient sufficiency signal is combined with stimulatory signaling from a mitogen-responsive pathway, to coordinate a process that requires an abundance of energy and the uptake of extracellular amino acids. Two key downstream targets of PI3K/TOR signaling are the ribosomal S6 kinases S6K1 and S6K2. The S6Ks play critical roles in the modulation of cell growth and cell cycle progression (reviewed in Fumagalli and Thomas, 2000). S6K inactivation inhibits or slows cell cycle progression in many eucaryotic cell types (e.g. Chung et al, 1992), and Drosophila melanogaster mutants harboring loss-of-function alleles of the S6K ortholog dS6K are developmentally delayed and significantly smaller than their wild–type (wt) counterparts (Montagne et al, 1999). Similarly, deletion of the murine S6K1 ortholog yields a small mouse (Shima et al, 1998), possessing significantly smaller pancreatic β-cells (Pende et al, 2000). How S6K signaling regulates translation is unknown. S6K1 was one of the first mitogen-activated protein kinases to be characterized (Jenö et al, 1988), yet the only S6K substrate involved in translation identified to date was the S6 ribosomal protein. Notably, S6 phosphorylation levels are normal in S6K1 null murine embryo fibroblasts (presumably due to the presence of S6K2; Shima et al, 1998), suggesting that a lack of S6 phosphorylation is not responsible for the observed small mouse phenotype. Thus, S6 phosphorylation does not appear to mediate all of the effects of the S6Ks on cell growth and proliferation. To better understand the role of eIF4B phosphorylation in the control of translation initiation, we sought to identify the location of the phosphorylation sites within the eIF4B protein, and to characterize the intracellular signaling pathways that regulate eIF4B phosphorylation. Here, we unambiguously identify a serum and mitogen-responsive phosphorylation site, and present strong evidence that phosphorylation of this site is modulated by S6K signaling. Since eIF4B plays a critical role in the loading of ribosomes onto the mRNA 5′UTR, we suggest that eIF4B may mediate some of the effects of S6K signaling on translation. Results eIF4B phosphopeptide mapping eIF4B phosphorylation is stimulated by serum or mitogen addition to quiescent cells in culture, and eIF4B hyperphosphorylation correlates with increased translation rates (Duncan and Hershey, 1985; Duncan and Hershey, 1987). To further characterize the regulation of eIF4B by phosphorylation, immunoprecipitated eIF4B labeled in vivo with [32P]orthophosphate was subjected to two-dimensional phosphopeptide mapping (see Materials and methods). eIF4B isolated from serum-deprived 293 cells yields a single major phosphopeptide (Figure 1A), while eIF4B immunoprecipitated from serum-stimulated cells yields two major phosphopeptides (Figure 1B). Thus, while the intensity of peptide 1 is unaffected by serum stimulation, a dramatic increase in the phosphorylation state of peptide 2 is observed in response to serum treatment, indicating a change in the phosphorylation status of one or more amino-acid residues. Phosphopeptides 1 and 2 were eluted from the chromatography plate and subjected to phosphoamino-acid analysis (van der Geer et al, 1994). These phosphopeptides contain only phosphoserine (data not shown). Analysis of the entire endogenous eIF4B protein isolated from 32P-labeled 293 or HeLa cells also yielded only phosphoserine (not shown). Figure 1.Phosphorylation of a single major eIF4B peptide is modulated by serum, and is sensitive to pharmacological inhibitors of PI3K and mTOR. Phosphopeptide mapping of endogenous eIF4B isolated from 293 cells, (A) starved of serum for 36 h; (B) starved of serum, and then serum stimulated for 30 min; (C) starved of serum, pretreated with 5 μM LY294002 for 30 min, and then serum stimulated for 30 min; or (D) starved of serum, pretreated with 50 nM rapamycin for 30 min, and then serum stimulated for 30 min. The two major phosphopeptides are numbered, and the loading origin is indicated by an arrow. The position of the diminished phosphopeptide 2 is indicated with a dashed circle. A vertical streaked signal near the loading origin is also observed, but this signal does not appear to be responsive to serum stimulation nor sensitive to kinase inhibitors. Download figure Download PowerPoint PI3K and mTOR signaling modulate eIF4B phosphorylation The PI3K and mTOR signaling modules have been implicated in translational control, and several translation regulatory factors have been identified as targets of PI3K and mTOR signaling (reviewed in Fumagalli and Thomas, 2000; Raught et al, 2000b). It was thus pertinent to test whether the serum-stimulated phosphorylation of eIF4B is also regulated via these pathways. To this end, serum-starved 293 cells metabolically labeled with [32P]orthophosphate were treated with various kinase inhibitors for 30 min, followed by serum stimulation for 30 min. eIF4B was then immunoprecipitated and subjected to phosphopeptide mapping, as above. Pretreatment with the PI3K inhibitors LY294002 (5 μM; Figure 1C) or wortmannin (100 nM, data not shown), or with an inhibitor of mTOR signaling, rapamycin (50 nM; Figure 1D), significantly decreased the serum-stimulated phosphorylation of peptide 2. These inhibitors had no apparent effect on the phosphorylation state of peptide 1. The serum-stimulated phosphorylation of peptide 2 therefore appears to require PI3K and mTOR signaling. S6Ks phosphorylate eIF4B in vitro on a physiologically relevant site Our mapping data suggested that the serum-stimulated phosphorylation of eIF4B phosphopeptide 2 is effected primarily via a rapamycin-sensitive signaling module. Three rapamycin-sensitive kinases previously demonstrated to play important roles in the regulation of translation, mTOR, S6K1 and S6K2, were therefore tested for their ability to phosphorylate eIF4B in vitro. Recombinant eIF4B protein possessing an N-terminal glutathione S-transferase (GST) tag was expressed in Escherichia coli and purified. GST-eIF4B was then incubated with [γ-32P]ATP and GST-tagged S6K1 or S6K2 proteins (purified from 293T cell extracts, as in Weng et al, 1995; Dennis et al, 1998), or an immunoprecipitate of endogenous mTOR from rat brain (as in Brunn et al, 1996). While GST-eIF4B alone did not incorporate significant levels of 32P in this assay, GST-S6K1 (Figure 2A) and GST-S6K2 (data not shown) readily phosphorylated eIF4B in vitro. GST-eIF4B was also incubated with a kinase-dead version of GST-S6K1. As in the absence of kinase, only background levels of 32P were incorporated into GST-eIF4B, and no resolvable phosphopeptides were observed via two-dimensional phosphopeptide mapping (not shown). Finally, while the mTOR immunoprecipitate exhibited kinase activity toward recombinant 4E-BP1 protein, it did not display significant eIF4B kinase activity (data not shown). Figure 2.S6K1 phosphorylates eIF4B in vitro on a phosphopeptide comigrating with the endogenous serum-stimulated phosphopeptide 2. (A) Recombinant eIF4B was labeled in vitro with S6K1; or (B) immunoprecipitated from 32P-labeled 293 cells, and subjected to phosphopeptide mapping. (C) The in vitro- and in vivo-labeled samples were then mixed, and subjected to phosphopeptide mapping. Download figure Download PowerPoint To ascertain whether the site(s) phosphorylated in vitro by S6K1/2 corresponds to a bona fide in vivo phosphorylation site, recombinant GST-eIF4B protein labeled in vitro with S6K1 was subjected to phosphopeptide mapping. The full-length, in vitro-labeled eIF4B protein yields a single phosphopeptide (Figure 2A) that migrates in the same region as the in vivo phosphopeptide 2 (Figure 2B). Mixing the recombinant eIF4B protein labeled in vitro with immunoprecipitated endogenous eIF4B protein labeled in vivo yielded a phosphopeptide pattern identical to the endogenous protein alone (Figure 2C). The phosphopeptide generated in vitro thus comigrates with the serum-responsive, rapamycin-sensitive phosphopeptide 2, strongly suggesting that the phosphopeptide generated in vitro is identical to that generated in vivo. Localization of eIF4B phosphorylation sites To delineate the region(s) of the eIF4B protein phosphorylated by S6K1 in vitro, six contiguous (His6)-tagged eIF4B fragments, each comprised of ∼100 aa (Figure 3A), were expressed in E. coli, purified via Ni2+ affinity chromatography, and then subjected to SDS–PAGE and Coomassie blue staining (Figure 3B). The fragments were also incubated with [γ-32P]ATP and tagged S6K1 protein (as above), and then subjected to SDS–PAGE and autoradiography (Figure 3C). Only fragment 5, encompassing aa 380–480, incorporated significant amounts of 32P in this assay. Two serines within a consensus S6K1 phosphorylation site (Flotow and Thomas, 1992) are present in fragment 5, Ser406 and Ser422. Figure 3.(A) Schematic representation of His6-eIF4B fragments. Six contiguous hexahistidine-tagged fragments comprised of ∼100 residues each were generated. The RRM, DRYG domain and ARM RNA-binding domain are indicated. (B) Recombinant fragments were purified by Ni2+ affinity chromatography, and then subjected to SDS–PAGE and Coomassie blue staining. (C) Equal amounts of the same fragments were phosphorylated by S6K1 in vitro. Lane numbers indicate eIF4B fragment number. The arrow indicates autophosphorylated S6K1. Download figure Download PowerPoint Ser422 is phosphorylated by S6K1 in vitro Ser406 and Ser422 were mutated to Ala, Asp or Thr residues in the context of the full-length His6-eIF4B protein. These proteins were expressed in E. coli, purified, 32P-labeled in vitro with GST-S6K1, and subjected to phosphopeptide mapping. The 32P-labeled wt His6-eIF4B protein yielded a single major phosphopeptide, as above (Figure 4A). The Ser406Ala mutation had no effect on the phosphopeptide map of in vitro-phosphorylated eIF4B (not shown). However, mutation of Ser422 to Ala or Asp abrogated the phosphorylation of this peptide (not shown). Surprisingly, mutation of Ser422 to Thr also abrogated phosphorylation of this residue by S6K1 (Figure 4B). Identical results were observed with S6K2 (data not shown). These data thus strongly suggest that Ser422 is phosphorylated by S6K1/2 in vitro. Interestingly, these results also indicate a marked preference for serine at this site, as replacement of Ser422 with threonine, even in the context of an S6K consensus phosphorylation sequence, abrogated phosphorylation of this residue in vitro. Figure 4.Ser422 is phosphorylated in vivo, and is phosphorylated in vitro by S6K1. Recombinant (A) wt and (B) Ser422Thr eIF4B proteins were phosphorylated in vitro with S6K1, and then subjected to phosphopeptide mapping. Similarly, Flag-tagged eIF4B (C) wt, (D) Ser406Ala and (E) Ser422Thr proteins were expressed in 293T cells, 32P-labeled in vivo and subjected to phosphopeptide mapping. Download figure Download PowerPoint Ser422 is phosphorylated in vivo To determine whether eIF4B Ser422 is phosphorylated in vivo, various Flag-tagged eIF4B proteins were expressed in 293T cells. Phosphopeptide mapping of wt Flag-eIF4B yielded a pattern identical to the endogenous eIF4B protein (Figure 4C). Mutation of Ser406 to Asp (not shown) or Ala (Figure 4D) had no effect on the phosphopeptide pattern. However, mutation of Ser422 to Ala or Asp (not shown) eliminated phosphopeptide 2. Reminiscent of the in vitro data, mutation of Ser422 to Thr also abrogated phosphorylation of peptide 2 in vivo (Figure 4E). Thus, eIF4B Ser422 also appears to be phosphorylated in vivo. It remained possible that amino-acid substitutions at Ser422 alter eIF4B structure to prevent phosphorylation on another residue. To verify that phosphorylation occurs at this site, antisera directed against the phosphopeptide (C)ERSRTGpSESSQT (corresponding to eIF4B residues 416-427, with an N-terminal Cys) were prepared, as described in Materials and methods. The Ser422 phosphospecific antiserum weakly detected an ∼80 kDa protein in serum-starved HeLa cells (Figure 5A, lane 1). This signal was dramatically enhanced, however, in serum-stimulated cells (lane 2). The phosphospecific antiserum did not recognize the Ser422Ala, Ser422Asp or Ser422Thr mutant Flag-tagged eIF4B proteins expressed in 293 cells (not shown). The signal detected by the Ser422 phosphospecific antiserum was specifically depleted by preincubation with the eIF4B 416–427 phosphopeptide (Figure 5A, lanes 3 and 4), but not by the corresponding unphosphorylated peptide (lanes 5 and 6), indicating that this antisera specifically recognizes the phosphorylated form of the protein. Figure 5.A phosphospecific antiserum confirms that phosphorylation of Ser422 is serum responsive, and is sensitive to rapamycin treatment and leucine deprivation. (A) Cells were starved of serum (odd-numbered lanes), or starved of serum and then serum stimulated (even-numbered lanes). Lysates were subjected to Western analysis using the phosphospecific eIF4B Ser422 antiserum (lanes 1 and 2). Preincubation of the antiserum with the phosphopeptide against which it was raised (lanes 3 and 4), or with the same peptide containing an unphosphorylated Ser422 (lanes 5 and 6). eIF4B expression levels were not affected by these treatments (lanes 7 and 8). (B) Cells were pretreated with rapamycin, and subjected to Western analysis using the phosphospecific antiserum (top panel) and antisera directed against total eIF4B (middle panel), as above. The same lysates were subjected to Western analysis using a phosphospecific antibody directed against S6K1 Thr389 (lower panel). (C) Cells were subjected to leucine-free (but otherwise complete) culture media for the indicated time periods. Lysates were subjected to Western blotting using the eIF4B Ser422 phosphospecific antiserum (top panel), a phosphorylation-independent antiserum directed against eIF4B (middle panel) or a phosphospecific antiserum directed against ribosomal S6 protein Ser235/236 (lower panel). Download figure Download PowerPoint Consistent with the phosphopeptide mapping analyses, pretreatment with rapamycin significantly diminished the serum-stimulated phosphorylation of eIF4B Ser422 (Figure 5B, lane 4, upper panel). Western analysis of an identical blot using a phosphorylation state-independent eIF4B antibody demonstrated that this treatment regimen does not affect eIF4B expression levels (middle panel). The same lysates were also subjected to Western blotting using a phosphospecific antibody directed against S6K1 Thr389 (a rapamycin-sensitive phosphoresidue in the catalytic domain; bottom panel). As expected, serum addition dramatically increased the phosphorylation state of this residue, and rapamycin treatment abrogated Thr389 phosphorylation, indicating that Thr389 phosphorylation, which is required for S6K activity, is correlated with eIF4B Ser422 phosphorylation in these cells. Thus, a phosphospecific antibody directed against eIF4B Ser422 confirmed that this residue is phosphorylated, and that the phosphorylation state of this site is modulated by serum addition, and is sensitive to rapamycin treatment (lane 4, upper panel). Ser422 phosphorylation is responsive to amino-acid deprivation Translation initiation is extremely sensitive to environmental amino-acid supply (Kimball and Jefferson, 2000). In particular, decreased levels of the essential branched-chain amino acid leucine elicit a potent inhibition of S6K activity (Shigemitsu et al, 1999; Anthony et al, 2000). To determine whether eIF4B Ser422 phosphorylation is also modulated by environmental amino-acid levels, cells were maintained in culture media lacking only leucine, and the phosphospecific antiserum was utilized to monitor Ser422 phosphorylation levels (Figure 5C). A gradual decrease in Ser422 phosphorylation was observed, such that after 90 min of leucine deprivation it was significantly diminished (upper panel). Cells maintained in complete media containing leucine demonstrated no loss of Ser422 phosphorylation over the same time course (not shown), and leucine deprivation had no effect on eIF4B expression levels (middle panel). As expected, leucine deprivation also elicited a decrease in ribosomal S6 protein Ser235/236 phosphorylation (lower panel). Thus, consistent with the amino-acid-responsive S6Ks effecting eIF4B phosphorylation, Ser422 phosphorylation is sensitive to leucine deprivation. S6Ks modulate eIF4B Ser422 phosphorylation in vivo: rapamycin-resistant S6K proteins confer rapamycin resistance to Ser422 Activation of the S6K1/2 kinases is a complex process, involving multiple phosphorylation events (reviewed in Fumagalli and Thomas, 2000). When several Ser/Thr residues in the C-terminal autoinhibitory domain are mutated to Asp or Glu, and Thr389 is mutated to Glu, the resulting mutant kinase (D3E-E389) acquires resistance to rapamycin. Similarly, deletion of the C-terminal autoinhibitory domain yields a kinase (ΔCT104) that displays rapamycin resistance (Cheatham et al, 1995; Pearson et al, 1995; Weng et al, 1995; Dennis et al, 1996). To determine whether S6K signaling can modulate eIF4B Ser422 phosphorylation in vivo, various S6K1 constructs were cotransfected with Flag-tagged wt eIF4B, and eIF4B phosphorylation was examined via phosphopeptide mapping. Cotransfected 293 cells were starved of serum for 36 h, and then metabolically labeled with [32P]orthophosphate. Labeled cells were pretreated with rapamycin for 30 min, and then stimulated with 10% FBS, as above. Flag-tagged wt eIF4B cotransfected with an empty vector (Figure 6A and B) or coexpressed with wt S6K1 protein (C and D) responded normally to serum addition, and remained sensitive to rapamycin treatment. Strikingly, however, eIF4B cotransfected with the rapamycin-resistant D3E-E389 (Figure 6E and F) or ΔCT104 S6K1 mutants (G and H) acquired resistance to rapamycin. Thus, as evidenced by its ability to confer rapamycin resistance upon eIF4B phosphorylation, S6K1 alone is sufficient to modulate eIF4B Ser422 phosphorylation in vivo. Figure 6.S6K1 mutants confer rapamycin resistance to eIF4B phosphorylation in vivo. Wt Flag-eIF4B was cotransfected into 293 cells with empty vector (A, B), wt S6K1 (C, D) or two different rapamycin-resistant S6K1 proteins (E–H), as indicated. Cells were starved of serum for 36 h, and then stimulated with serum for 30 min (A, C, E, G), or pretreated for 30 min with rapamycin (B, D, F, H) prior to serum stimulation. Flag-eIF4B was isolated and subjected to phosphopeptide mapping, as above. Download figure Download PowerPoint A Ser422 substitution interferes with eIF4B activity in vivo To determine whether Ser422 phosphorylation affects the ability of eIF4B to modulate translation initiation, 293T cells were transiently transfected to overexpress various mutant forms of Flag-tagged eIF4B with substitutions at Ser422 designed to prevent (Ser422Ala) or mimic (Ser422Glu) phosphorylation at this residue. Cells were cotransfected with vectors coding for secretable growth hormone (GH). As shown in Figure 7A, overexpression of wt eIF4B resulted in a notable inhibition of GH protein synthesis (compare lanes 1 and 4, lower panel). Inhibition of protein synthesis in vivo by high levels of eIF4B has been reported previously (Milburn et al, 1990), and is also observed when exogenous eIF4B is added to a reticulocyte lysate (data not shown). When the eIF4B Ser422Glu mutant was overexpressed, a similar extent of inhibition of GH synthesis was observed (lane 3, lower panel). However, when the nonphosphorylatable Ser422Ala mutant was overexpressed, the inhibition of GH synthesis was significantly attenuated (lane 2, lower panel), even though comparable amounts of eIF4B protein were produced (middle panel). Similar results were obt