Abstract Cell identity is governed by the complex regulation of gene expression, represented as gene-regulatory networks 1 . Here we use gene-regulatory networks inferred from single-cell multi-omics data to perform in silico transcription factor perturbations, simulating the consequent changes in cell identity using only unperturbed wild-type data. We apply this machine-learning-based approach, CellOracle, to well-established paradigms—mouse and human haematopoiesis, and zebrafish embryogenesis—and we correctly model reported changes in phenotype that occur as a result of transcription factor perturbation. Through systematic in silico transcription factor perturbation in the developing zebrafish, we simulate and experimentally validate a previously unreported phenotype that results from the loss of noto , an established notochord regulator. Furthermore, we identify an axial mesoderm regulator, lhx1a . Together, these results show that CellOracle can be used to analyse the regulation of cell identity by transcription factors, and can provide mechanistic insights into development and differentiation.

Abstract Complex gene regulatory mechanisms underlie differentiation and reprogramming. Contemporary single-cell lineage tracing (scLT) methods use expressed, heritable DNA barcodes to combine cell lineage readout with single-cell transcriptomics enabling high-resolution analysis of cell states while preserving lineage relationships. However, reliance on transcriptional profiling limits their adaptation to an ever-expanding tool kit of multiomic single-cell assays. With CellTag-multi, we present a novel approach for independently profiling lineage barcodes with single-cell chromatin accessibility without relying on co-assay of transcriptional state, paving the way for truly multiomic lineage tracing. We validate CellTag-multi in mouse hematopoiesis, characterizing transcriptional and epigenomic lineage priming across progenitor cell populations. In direct reprogramming of fibroblasts to endoderm progenitors, we use CellTag-multi to comprehensively link early cell state with reprogramming outcomes, identifying core regulatory programs underlying on-target and off-target reprogramming. Further, we reveal the Transcription Factor (TF) Zfp281 as a novel regulator of reprogramming outcome, biasing cells towards an off-target mesenchymal fate via its regulation of TGF-β signaling. Together, these results establish CellTag-multi as a novel lineage tracing method compatible with multiple single-cell modalities and demonstrate its utility in revealing fate-specifying gene regulatory changes across diverse paradigms of differentiation and reprogramming.

Abstract Recovery of cardiac function is the ultimate goal of heart failure therapy. Unfortunately, cardiac recovery remains a rare and poorly understood phemomenon. Herein, we performed single nucleus RNA-sequencing (snRNA-seq) from non-diseased donors and heart failure patients. By comparing patients who recovered LV systolic function following LV assist device implantation to those who did not recover and donors, we defined the cellular and transcriptional landscape and predictors of cardiac recovery. We sequenced 40 hearts and recovered 185,881 nuclei with 13 distinct cell types. Using pseudobulk differential expression analysis to explicate cell specific signatures of cardiac recovery, we observed that recovered cardiomyocytes do not revert to a normal state, and instead, retain transcriptional signatures observed in heart failure. Macrophages and fibroblasts displayed the strongest signatures of recovery. While some evidence of reversion to a normal state was observed, many heart failure associated genes remained elevated and recovery signatures were predominately indicative of a biological state that was unique from donor and heart failure conditions. Acquisition of recovery states was associated with improved LV systolic function. Pro-inflammatory macrophages and inflammatory signaling in fibroblasts were identified as negative predictors of recovery. We identified downregulation of RUNX1 transcriptional activity in macrophages and fibroblasts as a central event associated with and predictive of cardiac recovery. In silico perturbation of RUNX1 in macrophages and fibroblasts recapitulated the transcriptional state of cardiac recovery. This prediction was corroborated in a mouse model of cardiac recovery mediated by BRD4 inhibition where we observed a decrease in macrophage and fibroblast Runx1 expression, diminished chromatin accessibility within peaks linked to the Runx1 locus, and acquisition of recovery signatures. These findings suggest that cardiac recovery is a unique biological state and identify RUNX1 as a possible therapeutic target to facilitate cardiac recovery.

Summary In direct lineage reprogramming, transcription factor (TF) overexpression reconfigures Gene Regulatory Networks (GRNs) to convert cell identities between fully differentiated cell types. We previously developed CellOracle, a computational pipeline that integrates single-cell transcriptome and epigenome profiles to infer GRNs. CellOracle leverages these inferred GRNs to simulate gene expression changes in response to TF perturbation, enabling network re-configuration during reprogramming to be interrogated in silico. Here, we integrate CellOracle analysis with lineage tracing of fibroblast to induced endoderm progenitor (iEP) conversion, a prototypical direct lineage reprogramming paradigm. By linking early network state to reprogramming success or failure, we reveal distinct network configurations underlying different reprogramming outcomes. Using these network analyses and in silico simulation of TF perturbation, we identify new factors to coax cells into successfully converting cell identity, uncovering a central role for the AP-1 subunit Fos with the Hippo signaling effector, Yap1. Together, these results demonstrate the efficacy of CellOracle to infer and interpret cell-type-specific GRN configurations at high resolution, providing new mechanistic insights into the regulation and reprogramming of cell identity.

Abstract Background & Aims The small intestine (SI) displays regionality in nutrient and immunological function. Following SI tissue loss (as occurs in short gut syndrome, or SGS), remaining SI must compensate, or ‘adapt’; the capacity of SI epithelium to reprogram its regional identity has not been described. Here, we apply single-cell resolution analyses to characterize molecular changes underpinning adaptation to SGS. Methods Single-cell RNA-sequencing was performed on epithelial cells isolated from distal SI of mice following 50% proximal small bowel resection (SBR) vs. sham surgery. Single-cell profiles were clustered based on transcriptional similarity, reconstructing differentiation events from intestinal stem cells (ISCs) through to mature enterocytes. An unsupervised computational approach to score cell identity was used to quantify changes in regional (proximal vs distal) SI identity, validated using immunofluorescence, immunohistochemistry, qPCR, western blotting, and RNA-FISH. Results Uniform Manifold Approximation and Projection-based clustering and visualization revealed differentiation trajectories from ISCs to mature enterocytes in sham and SBR. Cell identity scoring demonstrated segregation of enterocytes by regional SI identity: SBR enterocytes assumed more mature proximal identities. This was associated with significant upregulation of lipid metabolism and oxidative stress gene expression, which was validated via orthogonal analyses. Observed upstream transcriptional changes suggest retinoid metabolism and proximal transcription factor Creb3l3 drive proximalization of cell identity in response to SBR. Conclusions Adaptation to proximal SBR involves regional reprogramming of ileal enterocytes toward a proximal identity. Interventions bolstering the endogenous reprogramming capacity of SI enterocytes—conceivably by engaging the retinoid metabolism pathway—merit further investigation, as they may increase enteral feeding tolerance, and obviate intestinal failure, in SGS. Synopsis Here, single-cell RNA sequencing reveals interactions between the retinoid metabolism pathway and ‘regional reprogramming’ of distal small intestinal epithelium to a proximal identity following proximal small bowel resection. This provides novel insight into physiological adaptation to short gut syndrome.

Here, we present CellOracle, a computational tool that integrates single-cell transcriptome and epigenome profiles to infer gene regulatory networks (GRNs), critical regulators of cell identity. Leveraging inferred GRNs, we simulate gene expression changes in response to transcription factor (TF) perturbation, enabling network configurations to be interrogated in silico, facilitating their interpretation. We validate the efficacy of CellOracle to recapitulate known regulatory changes across hematopoiesis, correctly predicting the outcomes of well-characterized TF perturbations. Integrating CellOracle analysis with lineage tracing of direct reprogramming reveals distinct network configurations underlying different reprogramming failure modes. Furthermore, analysis of GRN reconfiguration along successful reprogramming trajectories identifies new factors to enhance target cell yield, uncovering a role for the AP-1 subunit Fos, with the hippo signaling effector, Yap1. Together, these results demonstrate the efficacy of CellOracle to infer and interpret cell-type-specific GRN configurations, at high-resolution, promoting new mechanistic insights into the regulation and reprogramming of cell identity. CellOracle code and documentation are available at https://github.com/morris-lab/CellOracle.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

Single-cell technologies have seen rapid advancements in recent years, presenting new analytical challenges and opportunities. These high-throughput assays increasingly require special consideration in experimental design, sample multiplexing, batch effect removal, and data interpretation. Here, we describe a lentiviral barcode-based multiplexing approach, 'CellTag Indexing', where we transduce and label samples that can then be pooled together for downstream experimentation and analysis. By introducing predefined genetic barcodes that are transcribed and readily detected, we can reliably read out sample identity and transcriptional state via single-cell profiling. We validate and demonstrate the utility of CellTag Indexing by sequencing transcriptomes at single-cell resolution using a variety of cell types including mouse pre-B cells, primary mouse embryonic fibroblasts, and human HEK293T cells. A unique feature of CellTag Indexing is that the barcodes are heritable. This enables cell populations to be tagged, pooled and tracked over time within the same experimental replicate, then processed together to minimize unwanted biological and technical variation. We demonstrate this feature of CellTagging in long-term tracking of cell engraftment and differentiation, in vivo, in a mouse model of competitive transplant into the large intestine. Together, this presents CellTag Indexing as a broadly applicable genetic multiplexing tool that is complementary with existing single-cell technologies.