Summary

 Interleukin-1β (IL-1β) is a cytokine whose bioactivity is controlled by activation of the inflammasome. However, in response to lipopolysaccharide, human monocytes secrete IL-1β independently of classical inflammasome stimuli. Here, we report that this constituted a species-specific response that is not observed in the murine system. Indeed, in human monocytes, lipopolysaccharide triggered an "alternative inflammasome" that relied on NLRP3-ASC-caspase-1 signaling, yet was devoid of any classical inflammasome characteristics including pyroptosome formation, pyroptosis induction, and K⁺ efflux dependency. Genetic dissection of the underlying signaling pathway in a monocyte transdifferentiation system revealed that alternative inflammasome activation was propagated by TLR4-TRIF-RIPK1-FADD-CASP8 signaling upstream of NLRP3. Importantly, involvement of this signaling cascade was limited to alternative inflammasome activation and did not extend to classical NLRP3 activation. Because alternative inflammasome activation embraces both sensitivity and promiscuity of TLR4, we propose a pivotal role for this signaling cascade in TLR4-driven, IL-1β-mediated immune responses and immunopathology in humans.

The innate immune defence of multicellular organisms against microbial pathogens requires cellular collaboration. Information exchange allowing immune cells to collaborate is generally attributed to soluble protein factors secreted by pathogen-sensing cells. Cytokines, such as type I interferons (IFNs), serve to alert non-infected cells to the possibility of pathogen challenge. Moreover, in conjunction with chemokines they can instruct specialized immune cells to contain and eradicate microbial infection. Several receptors and signalling pathways exist that couple pathogen sensing to the induction of cytokines, whereas cytosolic recognition of nucleic acids seems to be exquisitely important for the activation of type I IFNs, master regulators of antiviral immunity. Cytosolic DNA is sensed by the receptor cyclic GMP-AMP (cGAMP) synthase (cGAS), which catalyses the synthesis of the second messenger cGAMP(2'-5'). This molecule in turn activates the endoplasmic reticulum (ER)-resident receptor STING, thereby inducing an antiviral state and the secretion of type I IFNs. Here we find in murine and human cells that cGAS-synthesized cGAMP(2'-5') is transferred from producing cells to neighbouring cells through gap junctions, where it promotes STING activation and thus antiviral immunity independently of type I IFN signalling. In line with the limited cargo specificity of connexins, the proteins that assemble gap junction channels, most connexins tested were able to confer this bystander immunity, thus indicating a broad physiological relevance of this local immune collaboration. Collectively, these observations identify cGAS-triggered cGAMP(2'-5') transfer as a novel host strategy that serves to rapidly convey antiviral immunity in a transcription-independent, horizontal manner.

Beyond adaptive immunity Prokaryotic CRISPR-Cas systems defend bacterial cells from phage and plasmid infection. Strecker et al. characterized a CRISPR-Cas system that functions beyond adaptive immunity (see the Perspective by Hou and Zhang). Type V-K CRISPR-Cas from cyanobacteria was associated with a Tn7-like transposon and a natural nuclease–deficient effector Cas12k. Cas12k directed the insertion of Tn7-like transposons into target sites via RNA-guided Tn7 transposition. This system was reprogrammed to efficiently and specifically insert DNA both in vitro and into the Escherichia coli genome. Science , this issue p. 48 ; see also p. 25

Detection of cytosolic DNA constitutes a central event in the context of numerous infectious and sterile inflammatory conditions. Recent studies have uncovered a bipartite mode of cytosolic DNA recognition, in which the cGAS-STING axis triggers antiviral immunity, whereas AIM2 triggers inflammasome activation. Here, we show that AIM2 is dispensable for DNA-mediated inflammasome activation in human myeloid cells. Instead, detection of cytosolic DNA by the cGAS-STING axis induces a cell death program initiating potassium efflux upstream of NLRP3. Forward genetics identified regulators of lysosomal trafficking to modulate this cell death program, and subsequent studies revealed that activated STING traffics to the lysosome, where it triggers membrane permeabilization and thus lysosomal cell death (LCD). Importantly, the cGAS-STING-NLRP3 pathway constitutes the default inflammasome response during viral and bacterial infections in human myeloid cells. We conclude that targeting the cGAS-STING-LCD-NLRP3 pathway will ameliorate pathology in inflammatory conditions that are associated with cytosolic DNA sensing.

Abstract Inflammasomes are multiprotein signaling platforms that form upon sensing microbe- or damage-associated molecular patterns. Upon their formation, caspase-1 is activated, leading to the processing of certain proinflammatory cytokines and the initiation of a special type of cell death, known as pyroptosis. Among known inflammasomes, NLRP3 takes on special importance because it appears to be a general sensor of cell stress. Moreover, unlike other inflammasome sensors, NLRP3 inflammasome activity is under additional transcriptional regulation. In this study, we identify the myeloid-specific microRNA miR-223 as another critical regulator of NLRP3 inflammasome activity. miR-223 suppresses NLRP3 expression through a conserved binding site within the 3′ untranslated region of NLRP3, translating to reduced NLRP3 inflammasome activity. Although miR-223 itself is not regulated by proinflammatory signals, its expression varies among different myeloid cell types. Therefore, given the tight transcriptional control of NLRP3 message itself, miR-223 functions as an important rheostat controlling NLRP3 inflammasome activity.

Inflammasomes are high molecular weight protein complexes that assemble in the cytosol upon pathogen encounter. This results in caspase-1-dependent pro-inflammatory cytokine maturation, as well as a special type of cell death, known as pyroptosis. The Nlrp3 inflammasome plays a pivotal role in pathogen defense, but at the same time, its activity has also been implicated in many common sterile inflammatory conditions. To this effect, several studies have identified Nlrp3 inflammasome engagement in a number of common human diseases such as atherosclerosis, type 2 diabetes, Alzheimer disease, or gout. Although it has been shown that known Nlrp3 stimuli converge on potassium ion efflux upstream of Nlrp3 activation, the exact molecular mechanism of Nlrp3 activation remains elusive. Here, we describe a genome-wide CRISPR/Cas9 screen in immortalized mouse macrophages aiming at the unbiased identification of gene products involved in Nlrp3 inflammasome activation. We employed a FACS-based screen for Nlrp3-dependent cell death, using the ionophoric compound nigericin as a potassium efflux-inducing stimulus. Using a genome-wide guide RNA (gRNA) library, we found that targeting Nek7 rescued macrophages from nigericin-induced lethality. Subsequent studies revealed that murine macrophages deficient in Nek7 displayed a largely blunted Nlrp3 inflammasome response, whereas Aim2-mediated inflammasome activation proved to be fully intact. Although the mechanism of Nek7 functioning upstream of Nlrp3 yet remains elusive, these studies provide a first genetic handle of a component that specifically functions upstream of Nlrp3. Inflammasomes are high molecular weight protein complexes that assemble in the cytosol upon pathogen encounter. This results in caspase-1-dependent pro-inflammatory cytokine maturation, as well as a special type of cell death, known as pyroptosis. The Nlrp3 inflammasome plays a pivotal role in pathogen defense, but at the same time, its activity has also been implicated in many common sterile inflammatory conditions. To this effect, several studies have identified Nlrp3 inflammasome engagement in a number of common human diseases such as atherosclerosis, type 2 diabetes, Alzheimer disease, or gout. Although it has been shown that known Nlrp3 stimuli converge on potassium ion efflux upstream of Nlrp3 activation, the exact molecular mechanism of Nlrp3 activation remains elusive. Here, we describe a genome-wide CRISPR/Cas9 screen in immortalized mouse macrophages aiming at the unbiased identification of gene products involved in Nlrp3 inflammasome activation. We employed a FACS-based screen for Nlrp3-dependent cell death, using the ionophoric compound nigericin as a potassium efflux-inducing stimulus. Using a genome-wide guide RNA (gRNA) library, we found that targeting Nek7 rescued macrophages from nigericin-induced lethality. Subsequent studies revealed that murine macrophages deficient in Nek7 displayed a largely blunted Nlrp3 inflammasome response, whereas Aim2-mediated inflammasome activation proved to be fully intact. Although the mechanism of Nek7 functioning upstream of Nlrp3 yet remains elusive, these studies provide a first genetic handle of a component that specifically functions upstream of Nlrp3.

Prokaryotic enzymes for viral defense The arms race between prokaryotes and viruses provides a strong evolutionary force to create diverse enzymatic activities that mediate antiviral immune responses. These immune components often cluster together in the host genomes, leading to expanded defense systems. Taking advantage of the evolutionary modularity of defense systems, Gao et al. bioinformatically predicted defense genes in most available bacterial and archaeal genomes. In addition, they reconstituted the newly identified systems in Escherichia coli and verified their defense functions against specific bacteriophages. In particular, they characterized defense functions for several predicted nucleoside triphosphatases. Science , this issue p. 1077

The pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to spread, with devastating consequences. For passive immunization efforts, nanobodies have size and cost advantages over conventional antibodies. In this study, we generated four neutralizing nanobodies that target the receptor binding domain of the SARS-CoV-2 spike protein. We used x-ray crystallography and cryo-electron microscopy to define two distinct binding epitopes. On the basis of these structures, we engineered multivalent nanobodies with more than 100 times the neutralizing activity of monovalent nanobodies. Biparatopic nanobody fusions suppressed the emergence of escape mutants. Several nanobody constructs neutralized through receptor binding competition, whereas other monovalent and biparatopic nanobodies triggered aberrant activation of the spike fusion machinery. These premature conformational changes in the spike protein forestalled productive fusion and rendered the virions noninfectious.

Abstract The type-V CRISPR effector Cas12b (formerly known as C2c1) has been challenging to develop for genome editing in human cells, at least in part due to the high temperature requirement of the characterized family members. Here we explore the diversity of the Cas12b family and identify a promising candidate for human gene editing from Bacillus hisashii , BhCas12b. However, at 37 °C, wild-type BhCas12b preferentially nicks the non-target DNA strand instead of forming a double strand break, leading to lower editing efficiency. Using a combination of approaches, we identify gain-of-function mutations for BhCas12b that overcome this limitation. Mutant BhCas12b facilitates robust genome editing in human cell lines and ex vivo in primary human T cells, and exhibits greater specificity compared to S. pyogenes Cas9. This work establishes a third RNA-guided nuclease platform, in addition to Cas9 and Cpf1/Cas12a, for genome editing in human cells.

Inflammasome activation culminates in activation of caspase‐1, which leads to the maturation and subsequent release of cytokines of the interleukin 1 (IL‐1) family and results in a particular form of cell death known as pyroptosis. In addition, in the murine system, a so‐called non‐canonical inflammasome involving caspase‐11 has been described that directly responds to cytosolic LPS. Here, we show that the human monocytic cell line THP1 activates the inflammasome in response to cytosolic LPS in a TLR4‐independent fashion. This response is mediated by caspase‐4 and accompanied by caspase‐1 activation, pyroptosis, and IL‐1β maturation. In addition to caspase‐4, efficient IL‐1β conversion upon intracellular LPS delivery relies on potassium efflux, NLRP3, ASC, and caspase‐1, indicating that although caspase‐4 activation alone is sufficient to induce pyroptosis, this process depends on the NLRP3 inflammasome activation to drive IL‐1β maturation. Altogether, this study provides evidence for the presence of a non‐canonical inflammasome in humans and its dependence on caspase‐4.