AM
Andreas Mund
Author with expertise in Mass Spectrometry Techniques with Proteins
Achievements
Cited Author
Open Access Advocate
Key Stats
Upvotes received:
0
Publications:
16
(69% Open Access)
Cited by:
922
h-index:
23
/
i10-index:
27
Reputation
Biology
< 1%
Chemistry
< 1%
Economics
< 1%
Show more
How is this calculated?
Publications
1

Ultra‐high sensitivity mass spectrometry quantifies single‐cell proteome changes upon perturbation

Andreas‐David Brunner et al.Feb 28, 2022
Article28 February 2022Open Access Transparent process Ultra-high sensitivity mass spectrometry quantifies single-cell proteome changes upon perturbation Andreas-David Brunner Andreas-David Brunner orcid.org/0000-0002-2733-7899 Proteomics and Signal Transduction, Max-Planck Institute of Biochemistry, Martinsried, Germany Contribution: Conceptualization, Data curation, Formal analysis, Validation, ​Investigation, Visualization, Methodology, Writing - original draft, Project administration, Writing - review & editing Search for more papers by this author Marvin Thielert Marvin Thielert Proteomics and Signal Transduction, Max-Planck Institute of Biochemistry, Martinsried, Germany Contribution: Data curation, Formal analysis, ​Investigation, Methodology Search for more papers by this author Catherine Vasilopoulou Catherine Vasilopoulou Proteomics and Signal Transduction, Max-Planck Institute of Biochemistry, Martinsried, Germany Contribution: Data curation, Formal analysis, ​Investigation, Methodology Search for more papers by this author Constantin Ammar Constantin Ammar orcid.org/0000-0003-4310-6908 Proteomics and Signal Transduction, Max-Planck Institute of Biochemistry, Martinsried, Germany Contribution: Data curation, Software, Formal analysis, ​Investigation, Methodology Search for more papers by this author Fabian Coscia Fabian Coscia orcid.org/0000-0002-2244-5081 NNF Center for Protein Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark Contribution: Resources, ​Investigation, Methodology Search for more papers by this author Andreas Mund Andreas Mund orcid.org/0000-0002-7843-5341 NNF Center for Protein Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark Contribution: Resources, ​Investigation, Methodology Search for more papers by this author Ole B Hoerning Ole B Hoerning EvoSep Biosystems, Odense, Denmark Contribution: Resources, Software, Methodology Search for more papers by this author Nicolai Bache Nicolai Bache EvoSep Biosystems, Odense, Denmark Contribution: Resources, Software, ​Investigation, Methodology Search for more papers by this author Amalia Apalategui Amalia Apalategui Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany Contribution: Resources, Software, Methodology Search for more papers by this author Markus Lubeck Markus Lubeck Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany Contribution: Resources, Software, ​Investigation, Methodology Search for more papers by this author Sabrina Richter Sabrina Richter orcid.org/0000-0001-6101-2783 Helmholtz Zentrum München – German Research Center for Environmental Health, Institute of Computational Biology, Neuherberg, Germany TUM School of Life Sciences Weihenstephan, Technical University of Munich, Freising, Germany Contribution: Data curation, Software, Formal analysis, ​Investigation, Visualization, Methodology Search for more papers by this author David S Fischer David S Fischer orcid.org/0000-0002-1293-7656 Helmholtz Zentrum München – German Research Center for Environmental Health, Institute of Computational Biology, Neuherberg, Germany TUM School of Life Sciences Weihenstephan, Technical University of Munich, Freising, Germany Contribution: Conceptualization, Software, Formal analysis, Validation, ​Investigation, Visualization, Methodology Search for more papers by this author Oliver Raether Oliver Raether Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany Contribution: Conceptualization, Resources, Software, Formal analysis, Supervision, ​Investigation, Methodology, Project administration Search for more papers by this author Melvin A Park Melvin A Park Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA, USA Contribution: Resources, Methodology Search for more papers by this author Florian Meier Florian Meier orcid.org/0000-0003-4729-175X Proteomics and Signal Transduction, Max-Planck Institute of Biochemistry, Martinsried, Germany Functional Proteomics, Jena University Hospital, Jena, Germany Contribution: Conceptualization, Resources, Supervision, ​Investigation, Methodology Search for more papers by this author Fabian J Theis Fabian J Theis orcid.org/0000-0002-2419-1943 Helmholtz Zentrum München – German Research Center for Environmental Health, Institute of Computational Biology, Neuherberg, Germany TUM School of Life Sciences Weihenstephan, Technical University of Munich, Freising, Germany Contribution: Conceptualization, Resources, Software, Formal analysis, Supervision, Funding acquisition, ​Investigation, Methodology Search for more papers by this author Matthias Mann Corresponding Author Matthias Mann [email protected] orcid.org/0000-0003-1292-4799 Proteomics and Signal Transduction, Max-Planck Institute of Biochemistry, Martinsried, Germany NNF Center for Protein Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark Contribution: Conceptualization, Resources, Supervision, Funding acquisition, ​Investigation, Methodology, Writing - original draft, Project administration, Writing - review & editing Search for more papers by this author Andreas-David Brunner Andreas-David Brunner orcid.org/0000-0002-2733-7899 Proteomics and Signal Transduction, Max-Planck Institute of Biochemistry, Martinsried, Germany Contribution: Conceptualization, Data curation, Formal analysis, Validation, ​Investigation, Visualization, Methodology, Writing - original draft, Project administration, Writing - review & editing Search for more papers by this author Marvin Thielert Marvin Thielert Proteomics and Signal Transduction, Max-Planck Institute of Biochemistry, Martinsried, Germany Contribution: Data curation, Formal analysis, ​Investigation, Methodology Search for more papers by this author Catherine Vasilopoulou Catherine Vasilopoulou Proteomics and Signal Transduction, Max-Planck Institute of Biochemistry, Martinsried, Germany Contribution: Data curation, Formal analysis, ​Investigation, Methodology Search for more papers by this author Constantin Ammar Constantin Ammar orcid.org/0000-0003-4310-6908 Proteomics and Signal Transduction, Max-Planck Institute of Biochemistry, Martinsried, Germany Contribution: Data curation, Software, Formal analysis, ​Investigation, Methodology Search for more papers by this author Fabian Coscia Fabian Coscia orcid.org/0000-0002-2244-5081 NNF Center for Protein Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark Contribution: Resources, ​Investigation, Methodology Search for more papers by this author Andreas Mund Andreas Mund orcid.org/0000-0002-7843-5341 NNF Center for Protein Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark Contribution: Resources, ​Investigation, Methodology Search for more papers by this author Ole B Hoerning Ole B Hoerning EvoSep Biosystems, Odense, Denmark Contribution: Resources, Software, Methodology Search for more papers by this author Nicolai Bache Nicolai Bache EvoSep Biosystems, Odense, Denmark Contribution: Resources, Software, ​Investigation, Methodology Search for more papers by this author Amalia Apalategui Amalia Apalategui Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany Contribution: Resources, Software, Methodology Search for more papers by this author Markus Lubeck Markus Lubeck Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany Contribution: Resources, Software, ​Investigation, Methodology Search for more papers by this author Sabrina Richter Sabrina Richter orcid.org/0000-0001-6101-2783 Helmholtz Zentrum München – German Research Center for Environmental Health, Institute of Computational Biology, Neuherberg, Germany TUM School of Life Sciences Weihenstephan, Technical University of Munich, Freising, Germany Contribution: Data curation, Software, Formal analysis, ​Investigation, Visualization, Methodology Search for more papers by this author David S Fischer David S Fischer orcid.org/0000-0002-1293-7656 Helmholtz Zentrum München – German Research Center for Environmental Health, Institute of Computational Biology, Neuherberg, Germany TUM School of Life Sciences Weihenstephan, Technical University of Munich, Freising, Germany Contribution: Conceptualization, Software, Formal analysis, Validation, ​Investigation, Visualization, Methodology Search for more papers by this author Oliver Raether Oliver Raether Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany Contribution: Conceptualization, Resources, Software, Formal analysis, Supervision, ​Investigation, Methodology, Project administration Search for more papers by this author Melvin A Park Melvin A Park Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA, USA Contribution: Resources, Methodology Search for more papers by this author Florian Meier Florian Meier orcid.org/0000-0003-4729-175X Proteomics and Signal Transduction, Max-Planck Institute of Biochemistry, Martinsried, Germany Functional Proteomics, Jena University Hospital, Jena, Germany Contribution: Conceptualization, Resources, Supervision, ​Investigation, Methodology Search for more papers by this author Fabian J Theis Fabian J Theis orcid.org/0000-0002-2419-1943 Helmholtz Zentrum München – German Research Center for Environmental Health, Institute of Computational Biology, Neuherberg, Germany TUM School of Life Sciences Weihenstephan, Technical University of Munich, Freising, Germany Contribution: Conceptualization, Resources, Software, Formal analysis, Supervision, Funding acquisition, ​Investigation, Methodology Search for more papers by this author Matthias Mann Corresponding Author Matthias Mann [email protected] orcid.org/0000-0003-1292-4799 Proteomics and Signal Transduction, Max-Planck Institute of Biochemistry, Martinsried, Germany NNF Center for Protein Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark Contribution: Conceptualization, Resources, Supervision, Funding acquisition, ​Investigation, Methodology, Writing - original draft, Project administration, Writing - review & editing Search for more papers by this author Author Information Andreas-David Brunner1, Marvin Thielert1, Catherine Vasilopoulou1, Constantin Ammar1, Fabian Coscia2, Andreas Mund2, Ole B Hoerning3, Nicolai Bache3, Amalia Apalategui4, Markus Lubeck4, Sabrina Richter5,6, David S Fischer5,6, Oliver Raether4, Melvin A Park7, Florian Meier1,8, Fabian J Theis5,6 and Matthias Mann *,1,2 1Proteomics and Signal Transduction, Max-Planck Institute of Biochemistry, Martinsried, Germany 2NNF Center for Protein Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark 3EvoSep Biosystems, Odense, Denmark 4Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany 5Helmholtz Zentrum München – German Research Center for Environmental Health, Institute of Computational Biology, Neuherberg, Germany 6TUM School of Life Sciences Weihenstephan, Technical University of Munich, Freising, Germany 7Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA, USA 8Functional Proteomics, Jena University Hospital, Jena, Germany *Corresponding author. E-mail: [email protected] Molecular Systems Biology (2022)18:e10798https://doi.org/10.15252/msb.202110798 PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Abstract Single-cell technologies are revolutionizing biology but are today mainly limited to imaging and deep sequencing. However, proteins are the main drivers of cellular function and in-depth characterization of individual cells by mass spectrometry (MS)-based proteomics would thus be highly valuable and complementary. Here, we develop a robust workflow combining miniaturized sample preparation, very low flow-rate chromatography, and a novel trapped ion mobility mass spectrometer, resulting in a more than 10-fold improved sensitivity. We precisely and robustly quantify proteomes and their changes in single, FACS-isolated cells. Arresting cells at defined stages of the cell cycle by drug treatment retrieves expected key regulators. Furthermore, it highlights potential novel ones and allows cell phase prediction. Comparing the variability in more than 430 single-cell proteomes to transcriptome data revealed a stable-core proteome despite perturbation, while the transcriptome appears stochastic. Our technology can readily be applied to ultra-high sensitivity analyses of tissue material, posttranslational modifications, and small molecule studies from small cell counts to gain unprecedented insights into cellular heterogeneity in health and disease. Synopsis A new ultra-high sensitivity LC-MS workflow increases sensitivity by up to two orders of magnitude and enables true single-cell proteome analysis. In-depth comparison indicates that the single-cell transcriptome is stochastic while the single-cell proteome is complete and stable. A highly optimized data independent acquisition powered single-cell proteomics workflow including sub-µl sample preparation, very low flow chromatography and trapped ion mobility mass spectrometry (diaPASEF) is presented. Single-cell proteome analysis is performed by injecting cells one-by-one across the cell cycle into the LC-MS and correctly identifies cell states. Single-cell proteome information is highly complementary to single-cell transcriptome information. At the single-cell level the proteome is quantitatively and qualitatively stable, while the transcriptome is stochastic. Introduction In single-cell analysis, biological variability can directly be attributed to individual cells instead of being averaged over an ensemble or complex tissue (Regev et al, 2017). While microscopy has always been single-cell based, specialized deep sequencing technologies have achieved this for systems biological approaches (Smith et al, 2010; Ramsköld et al, 2012; Jaitin et al, 2014; Schnitzbauer et al, 2017; Schaum et al, 2018; Lundberg & Borner, 2019). At the level of proteins, the functional actors of cells, single cells are currently studied by antibody-based technologies, which are by necessity directed against previously chosen targets (Uhlén et al, 2015; Stoeckius et al, 2017; Jackson et al, 2020). In contrast, mass spectrometry (MS)-based proteomics is unbiased in the sense that it measures all proteins within its range of detection (Larance & Lamond, 2015; Aebersold & Mann, 2016). Thus, it would be highly desirable to apply this technology to single cells if the required sensitivity and robustness could be achieved. Previous approaches that employed chemical multiplexing of peptides have labeled a small number of single cells but combined them with a dominant booster channel for MS analysis (Budnik et al, 2018; Tsai et al, 2020; Schoof et al, 2021), which can hamper signal deconvolution (Brenes et al, 2019; Cheung et al, 2021). Alternatively, proof of principle has been demonstrated for unlabeled approaches using sophisticated sample preparation methods in pico-liter devices (Li et al, 2018; Liang et al, 2020; Williams et al, 2020). Here, we set out to develop an ultrasensitive MS-based workflow that would allow quantitatively precise and accurate MS proteomics data by injecting single cells one by one into the MS—which we call true single-cell–derived proteomics (T-SCP). To achieve scale, robustness, and community adoption, we aimed to combine technologies that could readily be made commercially available. We apply our T-SCP technology to a drug perturbation experiment, capturing functional, dynamic responses on a single-cell population. Results Noise-reduced quantitative mass spectra We recently introduced parallel accumulation–serial fragmentation (PASEF), a mass spectrometric acquisition scheme in which peptide ions are released from a trapped ion mobility (TIMS) device into the vacuum system in concentrated packages (Meier et al, 2015, 2018). Chemical noise is widely distributed as a result of its heterogeneous nature and the 10-fold increased peak capacity due to TIMS (Fig 1A and B; Meier et al, 2020b). These precursors can be fragmented in a highly sensitive manner, either in data-dependent (ddaPASEF) or data-independent (diaPASEF) mode, resulting in very high ion utilization and data completeness (Meier et al, 2020a). To explore sensitivity limits of our initial LC-MS setup (See Material and Methods), we measured a dilution series of HeLa cell lysate from 25 ng down to the equivalent of a few single cells on a quadrupole time-of-flight instrument (TIMS-qTOF). This identified more than 550 proteins from 0.8 ng HeLa lysate with the DDA acquisition mode and a conservative MaxQuant analysis (Fig 1C; Cox & Mann, 2008). Proteins were quantified with the linear signal response expected from the dilution factors (Fig 1D). Furthermore, quantitative reproducibility in replicates at the lowest level was still excellent (R = 0.96, Fig 1E). Given that the protein amount of a single HeLa cell is as low as 150 pg (Volpe & Eremenko-Volpe, 1970), and accounting for inevitable losses in sample preparation including protein digestion, we estimated that we would need to increase sensitivity by at least an order of magnitude to enable true single-cell proteomics. Figure 1. TIMS enables virtually noise-free spectra and ultra-high sensitivity proteomics A, B. The TIMS-qTOF principle separating singly charged background peaks from multiply charged peptide precursor ions, making precursor ions visible at extremely low signal levels (0.8 ng HeLa digest). C. Quantified proteins from a HeLa digest dilution series from 25 ng peptide material down to 0.8 ng (arrow), roughly corresponding to the protein amount contained in three HeLa cells on our initial LC–MS setup (See Material and Methods). D. Linear quantitative response curve of the HeLa digest experiment in C (Box and Whiskers; The middle represents the median, the top and the bottom of the box represent the upper and lower quartile values of the data, and the whiskers represent the maximum and minimum value of the data). E. Quantitative reproducibility of two successive HeLa digest experiments at the lowest dilution (technical LC–MS/MS replicates). Download figure Download PowerPoint True single-cell proteome analysis Three main factors govern MS sensitivity: ionization efficiency, transfer efficiency into the vacuum system, and ion utilization by the instrument (Wilm & Mann, 1996). We first constructed an instrument with a brighter ion source, introduced different ion optic elements and optimized parameters such as detector voltage. Together, this led to a more than fourfold higher ion current (Fig 2A). Next, we FACS sorted zero, one, and up to six single HeLa cells in quadruplicate into individual 384 wells, processed them separately, and analyzed them on this modified mass spectrometer. This resulted on average in 843, 1,279, and 1,890 identified proteins for one, two, and six cells, respectively. Note that this analysis benefited from transferring peptide identifications on the MS1 level, as expected from extremely low sample amounts (Fig 2B). Protein identifications at zero cells are most likely a result of minimal contribution from previous runs since they map to the most abundant proteins of the six-cell measurements in a rank plot (Fig EV1A and B). Quantitative precision and accuracy were high when comparing single cells, not much reduced from comparing six cells (Fig 2C and D). A rank order abundance plot revealed that the measured single-cell proteome preferentially mapped to the higher abundant part of the six-cell proteome, indicating that proteome coverage depended deterministically on overall LC-MS sensitivity (Fig 2E). Inspecting shared peptides between the single-cell and six-cell experiment showed that clearly interpretable precursor isotope patterns were still present at high signal-to-noise levels even at single-cell level following the cell count intensity ratio trend (Fig 2F). Figure 2. A novel mass spectrometer allows the analysis of true single-cell proteomes Raw signal increase from standard versus modified TIMS-qTOF instrument (left) and at the evidence level (quantified peptide features in MaxQuant) (right). Proteins quantified from one to six single HeLa cells, either with “matching between runs” (MBR) in MaxQuant (orange) or without matching between runs (blue). The outlier in the three-cell measurement in grey (no MBR) or white (with MBR) is likely due to failure of FACS sorting as it identified a similar number of proteins as blank runs (Horizontal lines within each respective cell count indicate median values). Quantitative reproducibility in a rank order plot of a six-cell replicate experiment. Same as C for two independent single cells. Rank order of protein signals in the six-cell experiment (blue) with proteins quantified in a single cell colored in orange. Raw MS1-level spectrum of one precursor isotope pattern of the indicated sequence and shared between the single-cell (top) and six-cell experiments (bottom). Download figure Download PowerPoint Click here to expand this figure. Figure EV1. Technical feasibility assessment of ultra-high sensitivity mass spectrometry and liquid chromatography Ranked protein identifications for six-cell measurements with and without matching between runs. Zero-cell protein identifications are highlighted in orange and overlaid on the six-cell protein rank plot. The top 10 protein identifications of the zero-cell runs are depicted. True nanoflow at 25, 50, and 100 nl/min flow rate on the EvoSep One liquid chromatography system. Standardized 100 nl/min true nanoflow gradient on the EvoSep One liquid chromatography system. Pressure (Left) and flow profile (right) of the gradient of more than 1,000 consecutive runs (Day 1–Run #1 = gray; Day 20–Run #500 = orange; and Day 45–Run #1,000 = blue). Data completeness (Blue) and coefficient of variation (Orange) evaluation of different diaPASEF consecutive scan repetitions merged for the analysis of 1 ng tryptic HeLa digest. Scans were varied from one, three, and five repetitions. Download figure Download PowerPoint Ten-fold sensitivity increase As electrospray (ES) is concentration dependent, sensitivity increases with decreasing flow rate; however, very low flow systems are challenging to operate robustly and are consequently not widely available (Emmett & Caprioli, 1994; Wilm & Mann, 1996; Greguš et al, 2020). We recently described a chromatography system that decouples sample loading and gradient formation from the LC-MS run and operates at a standardized flow rate of 1 µl/min for high reproducibility (Bache et al, 2018). This flow is fully controlled by a single pump instead of the binary gradients produced by other systems. We found that it worked robustly at flow rates down to 25 nl/min but standardized on 100 nl/min, which enabled stable operation for the entire project with the same column-emitter setup (Fig EV1B and C). ES sprayer diameter and gradient length were optimized for turnover, minimizing carryover and stability. MS-based T-SCP requires loss-less sample preparation by protein isolation and solubilization, followed by tryptic protein digestion and peptide purification ready for MS analysis (Budnik et al, 2018; Li et al, 2018; Zhu et al, 2018; Greguš et al, 2020; Williams et al, 2020). We found that small volumes of weak organic solvents in conical 384-well plates provided a versatile and automatable environment for efficient cell lysis and protein digestion in minimal volumes (Fig 3A). Briefly, single cells were sorted into wells containing 1 µl lysis buffer, followed by a heating step and further addition of buffer containing digestion enzymes to a total of 2 µl, all in an enclosed space. Peptides were concentrated in a standard EvoTip device, which resembles the functionality of a StageTip (Rappsilber et al, 2007), into 20 nl nanopackages, from which they were eluted in minimal volumes (Fig 3B). To benchmark the effect of reduced flow rate and the concentrated peptide nanopackage elution, we directly compared signal traces of the normal 1 µl/min to the 100 nl/min setup. For 1 ng peptide material, this resulted in a 10-fold increase in signal (Fig 3C). To achieve high data completeness between hundreds of single-cell measurements, we next replaced ddaPASEF by diaPASEF, in which fragment-level matching is further supported by ion mobility data (Meier et al, 2020a). We found that combining subsequent diaPASEF scan repetitions further improved protein identification numbers. Together, the very low flow chromatography and this diaPASEF acquisition mode resulted in the highly reproducible identification and quantification of more than 3,900 HeLa proteins from only 1 ng (Fig 3D), a drastic increase from the 550 identified in our initial setup from a similar amount. Data completeness was at 92% and coefficient of variation (CV) < 10% for the selected scan repetition mode (Fig EV1D). This demonstrates that diaPASEF provides its advantages also at extremely low sample amounts, prompting us to adopt this acquisition mode for the single-cell workflow in the remainder of this work. Figure 3. Miniaturized sample preparation coupled to very low-flow chromatography and diaPASEF Single cells are sorted in a 384-well format into 1 µl lysis buffer by FACS with outer wells serving as qualitative and quantitative controls. Single cells are lysed and proteins are solubilized at 72°C in 20% acetonitrile, and digested at 37°C. Peptides are concentrated into 20 nl nanopackages in StageTips in a 96-well format. These tips are automatically picked and peptide nanopackages are eluted in a sub-100-nl volume. After valve switching, the peptide nanopackage is pushed on the analytical column and separated, fully controlled by the single high-pressure pump at 100 nl/min. Base–peak chromatogram of the standardized nanoflow (100 nl/min, orange) and microflow (1 µl/min, blue) gradients with 1 ng of HeLa digest on the StageTip. Asterices indicate polyethylene glycole contaminants in both runs. Nanoflow (100 nl/min) and short-gradient diaPASEF method combined. Summation of one to five diaPASEF scan repetitions was used to find the optimum for high-sensitivity measurements at 1 ng of HeLa digest. Download figure Download PowerPoint T-SCP dissects arrested cell cycle states The cell cycle is an important and well-studied biological process that has frequently been used as a test case in single-cell studies (Aviner et al, 2015; Ly et al, 2017). To investigate if our proteomics workflow could detect biological responses to drug perturbation at the single-cell level, we treated HeLa cells with thymidine and nocodazole to produce four cell populations enriched in specific cell cycle stages (231 cells; Fig 4A). We quantified up to 2,083 proteins per single cell and 2,501 overall using a HeLa dia spectral library with about 4,000 protein groups. This number ranged from a median of 1,018 in G1 to 1,932 in G1/S, 1,572 in G2, and 1,705 in G2/M (Fig 4B). The full data set, even though biologically heterogeneous, showed a median coefficient of variation (CV) of 0.3 across all genes and a clear dependence of the CV on protein intensity levels (Fig EV2A and B). To estimate the total protein amount per cell, we summed all protein signals based on their identifying peptides. Judged by protein amount, G2 cells were approximately 1.8-fold larger than G1 cells; thus, T-SCP correctly reflected the proliferation state, while highlighting a substantial heterogeneity within each cell cycle stage that would have been hidden in bulk sample analysis (Fig 4C). To be able to directly compare single-cell proteomes and cancel out protein abundance differences attributed to varying total protein amounts and identifications of each cell, we normalized our data using the retention time-dependent normalization module offered by the search engine DIA-NN across cells (Demichev et al, 2020; Fig EV2C). Furthermore, we stringently filtered our data set for at least 600 protein identifications per cell and more than 15% observations for each protein across remaining single cells (See Material and Methods). The proteomes of the different cell cycle states grouped together in a principal component analysis (PCA) plot (Fig 4D). In addition to these drug-perturbed cells, we measured more than 200 untreated ones from two independent cell culture batches. The proteomes of these asynchronous cells distributed well across the cell cycle states, while different passage batches were enriched in the G1 and G2 phase (Fig EV2D). This highlights that biological variation dominates remaining technical variation. The T-SCP data set covered proteins assigned to many cellular compartments, membranes, and biological processes involved in biological regulation, metabolism, transport, and signal transduction at high quantitative precision despite severe systematic perturbation introducing stark biological variation and proteome remodeling (Fig EV2E, Dataset EV1). Figure 4. T-SCP correctly quantifies cell cycle states Arresting single cells by drug perturbation. Numbers of protein identifications across 231 cells in the indicated cell cycle stages as enriched by the drug treatments in A (Dashed lines indicate the median number of identifications for each respective cell cycle stage). Boxplot of total protein signals of the single cells in B after filtering for at least 600 protein identifications per cell and 15% data completeness per protein across cells (G1: n = 84; G1-S: n = 41; G2: n = 52; and G2-M: n = 45); (Box and Whiskers; The middle represents the median, the top and the bottom of the box represent
0

Deep Visual Proteomics defines single-cell identity and heterogeneity

Andreas Mund et al.May 19, 2022
Despite the availabilty of imaging-based and mass-spectrometry-based methods for spatial proteomics, a key challenge remains connecting images with single-cell-resolution protein abundance measurements. Here, we introduce Deep Visual Proteomics (DVP), which combines artificial-intelligence-driven image analysis of cellular phenotypes with automated single-cell or single-nucleus laser microdissection and ultra-high-sensitivity mass spectrometry. DVP links protein abundance to complex cellular or subcellular phenotypes while preserving spatial context. By individually excising nuclei from cell culture, we classified distinct cell states with proteomic profiles defined by known and uncharacterized proteins. In an archived primary melanoma tissue, DVP identified spatially resolved proteome changes as normal melanocytes transition to fully invasive melanoma, revealing pathways that change in a spatial manner as cancer progresses, such as mRNA splicing dysregulation in metastatic vertical growth that coincides with reduced interferon signaling and antigen presentation. The ability of DVP to retain precise spatial proteomic information in the tissue context has implications for the molecular profiling of clinical samples.
0
Citation273
0
Save
229

AI-driven Deep Visual Proteomics defines cell identity and heterogeneity

Andreas Mund et al.Jan 27, 2021
ABSTRACT The systems-wide analysis of biomolecules in time and space is key to our understanding of cellular function and heterogeneity in health and disease 1 . Remarkable technological progress in microscopy and multi-omics technologies enable increasingly data-rich descriptions of tissue heterogeneity 2,3,4,5 . Single cell sequencing, in particular, now routinely allows the mapping of cell types and states uncovering tremendous complexity 6 . Yet, an unaddressed challenge is the development of a method that would directly connect the visual dimension with the molecular phenotype and in particular with the unbiased characterization of proteomes, a close proxy for cellular function. Here we introduce Deep Visual Proteomics (DVP), which combines advances in artificial intelligence (AI)-driven image analysis of cellular phenotypes with automated single cell laser microdissection and ultra-high sensitivity mass spectrometry 7 . DVP links protein abundance to complex cellular or subcellular phenotypes while preserving spatial context. Individually excising nuclei from cell culture, we classified distinct cell states with proteomic profiles defined by known and novel proteins. AI also discovered rare cells with distinct morphology, whose potential function was revealed by proteomics. Applied to archival tissue of salivary gland carcinoma, our generic workflow characterized proteomic differences between normal-appearing and adjacent cancer cells, without admixture of background from unrelated cells or extracellular matrix. In melanoma, DVP revealed immune system and DNA replication related prognostic markers that appeared only in specific tumor regions. Thus, DVP provides unprecedented molecular insights into cell and disease biology while retaining spatial information.
806

Ultra-high sensitivity mass spectrometry quantifies single-cell proteome changes upon perturbation

Andreas‐David Brunner et al.Dec 22, 2020
Abstract Single-cell technologies are revolutionizing biology but are today mainly limited to imaging and deep sequencing 1–3 . However, proteins are the main drivers of cellular function and in-depth characterization of individual cells by mass spectrometry (MS)-based proteomics would thus be highly valuable and complementary 4,5 . Chemical labeling-based single-cell approaches introduce hundreds of cells into the MS, but direct analysis of single cells has not yet reached the necessary sensitivity, robustness and quantitative accuracy to answer biological questions 6,7 . Here, we develop a robust workflow combining miniaturized sample preparation, very low flow-rate chromatography and a novel trapped ion mobility mass spectrometer, resulting in a more than ten-fold improved sensitivity. We accurately and robustly quantify proteomes and their changes in single, FACS-isolated cells. Arresting cells at defined stages of the cell cycle by drug treatment retrieves expected key regulators such as CDK2NA, the E2 ubiquitin ligase UBE2S, DNA topoisomerases TOP2A/B and the chromatin regulator HMGA1. Furthermore, it highlights potential novel ones and allows cell phase prediction. Comparing the variability in more than 430 single-cell proteomes to transcriptome data revealed a stable core proteome despite perturbation, while the transcriptome appears volatile. This emphasizes substantial regulation of translation and sets the stage for its elucidation at the single cell level. Our technology can readily be applied to ultra-high sensitivity analyses of tissue material 8 , posttranslational modifications and small molecule studies to gain unprecedented insights into cellular heterogeneity in health and disease.
0
Load More