Immune responses to cancer are highly variable, with mismatch repair-deficient (MMRd) tumors exhibiting more anti-tumor immunity than mismatch repair-proficient (MMRp) tumors. To understand the rules governing these varied responses, we transcriptionally profiled 371,223 cells from colorectal tumors and adjacent normal tissues of 28 MMRp and 34 MMRd individuals. Analysis of 88 cell subsets and their 204 associated gene expression programs revealed extensive transcriptional and spatial remodeling across tumors. To discover hubs of interacting malignant and immune cells, we identified expression programs in different cell types that co-varied across tumors from affected individuals and used spatial profiling to localize coordinated programs. We discovered a myeloid cell-attracting hub at the tumor-luminal interface associated with tissue damage and an MMRd-enriched immune hub within the tumor, with activated T cells together with malignant and myeloid cells expressing T cell-attracting chemokines. By identifying interacting cellular programs, we reveal the logic underlying spatially organized immune-malignant cell networks.

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a highly lethal and treatment-refractory cancer. Molecular stratification in pancreatic cancer remains rudimentary and does not yet inform clinical management or therapeutic development. Here, we construct a high-resolution molecular landscape of the cellular subtypes and spatial communities that compose PDAC using single-nucleus RNA sequencing and whole-transcriptome digital spatial profiling (DSP) of 43 primary PDAC tumor specimens that either received neoadjuvant therapy or were treatment naive. We uncovered recurrent expression programs across malignant cells and fibroblasts, including a newly identified neural-like progenitor malignant cell program that was enriched after chemotherapy and radiotherapy and associated with poor prognosis in independent cohorts. Integrating spatial and cellular profiles revealed three multicellular communities with distinct contributions from malignant, fibroblast and immune subtypes: classical, squamoid-basaloid and treatment enriched. Our refined molecular and cellular taxonomy can provide a framework for stratification in clinical trials and serve as a roadmap for therapeutic targeting of specific cellular phenotypes and multicellular interactions.

ABSTRACT Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) remains a treatment-refractory disease. Characterizing PDAC by mRNA profiling remains particularly challenging. Previously identified bulk expression subtypes were influenced by contaminating stroma and have not yet informed clinical management, whereas single cell RNA-seq (scRNA-seq) of fresh tumors under-represented key cell types. Here, we developed a robust single-nucleus RNA-seq (snRNA-seq) technique for frozen archival PDAC specimens and used it to study both untreated tumors and those that received neoadjuvant chemotherapy and radiotherapy (CRT). Gene expression programs learned across untreated malignant cell and fibroblast profiles uncovered a clinically relevant molecular taxonomy with improved prognostic stratification compared to prior classifications. Moreover, in the increasingly-adopted neoadjuvant treatment context, there was a depletion of classical-like phenotypes in malignant cells in favor of basal-like phenotypes associated with TNF-NFkB and interferon signaling as well as the presence of novel acinar and neuroendocrine classical-like states, which may be more resilient to cytotoxic treatment. Spatially-resolved transcriptomics revealed an association between malignant cells expressing these basal-like programs and higher immune infiltration with increased lymphocytic content, whereas those exhibiting classical-like programs were linked to sparser macrophage-predominant microniches, perhaps pointing to susceptibility to distinct therapeutic strategies. Our refined molecular taxonomy and spatial resolution can help advance precision oncology in PDAC through informative stratification in clinical trials and insights into differential therapeutic targeting leveraging the immune system.

Abstract Genome sequencing studies have identified millions of somatic variants in cancer, but their phenotypic impact remains challenging to predict. Current experimental approaches to distinguish between functionally impactful and neutral variants require customized phenotypic assays that often report on average effects, and are not easily scaled. Here, we develop a generalizable, high-dimensional, and scalable approach to functionally assess variant impact in single cells by pooled Perturb-seq. Specifically, we assessed the impact of 200 TP53 and KRAS variants in >300,000 single lung cancer cells, and used the profiles to categorize variants into phenotypic subsets to distinguish gain-of-function, loss-of-function and dominant negative variants, which we validated by comparison to orthogonal assays. Surprisingly, KRAS variants did not merely fit into discrete functional categories, but rather spanned a continuum of gain-of-function phenotypes driven by quantitative shifts in cell composition at the single cell level. We further discovered novel gain-of-function KRAS variants whose impact could not have been predicted solely by their occurrence in patient samples. Our work provides a scalable, gene-agnostic method for coding variant impact phenotyping, which can be applied in cancer and other diseases driven by somatic or germline coding mutations.

Abstract Mouse models are a tool for studying the mechanisms underlying complex diseases; however, differences between species pose a significant challenge for translating findings to patients. Here, we used single-cell transcriptomics and orthogonal validation approaches to provide cross-species taxonomies, identifying shared broad cell classes and unique granular cellular states, between mouse and human kidney. We generated cell atlases of the diabetic and obese kidney using two different mouse models, a high-fat diet (HFD) model and a genetic model (BTBR ob/ob ), at multiple time points along disease progression. Importantly, we identified a previously unrecognized, expanding Trem2 high macrophage population in kidneys of HFD mice that matched human TREM2 high macrophages in obese patients. Taken together, our cross-species comparison highlights shared immune and metabolic cell-state changes.

Abstract SARS-CoV-2, the coronavirus that causes COVID-19, binds to angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) on human cells. Beyond the lung, COVID-19 impacts diverse tissues including the kidney. ACE2 is a key member of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System (RAAS) which regulates blood pressure, largely through its effects on the kidney. RAAS blockers such as ACE inhibitors (ACEi) and Angiotensin Receptor Blockers (ARBs) are widely used therapies for hypertension, cardiovascular and chronic kidney diseases, and therefore, there is intense interest in their effect on ACE2 expression and its implications for SARS-CoV-2 pathogenicity. Here, we analyzed single-cell and single-nucleus RNA-seq of human kidney to interrogate the association of ACEi/ARB use with ACE2 expression in specific cell types. First, we performed an integrated analysis aggregating 176,421 cells across 49 donors, 8 studies and 8 centers, and adjusting for sex, age, donor and center effects, to assess the relationship of ACE2 with age and sex at baseline. We observed a statistically significant increase in ACE2 expression in tubular epithelial cells of the thin loop of Henle (tLoH) in males relative to females at younger ages, the trend reversing, and losing significance with older ages. ACE2 expression in tLoH increases with age in females, with an opposite, weak effect in males. In an independent cohort, we detected a statistically significant increase in ACE2 expression with ACEi/ARB use in epithelial cells of the proximal tubule and thick ascending limb, and endothelial cells, but the association was confounded in this small cohort by the underlying disease. Our study illuminates the dynamics of ACE2 expression in specific kidney cells, with implications for SARS-CoV-2 entry and pathogenicity.

Abstract Human iPSC-derived kidney organoids have the potential to revolutionize discovery, but assessing their consistency and reproducibility across iPSC lines, and reducing the generation of off-target cells remain an open challenge. Here, we used single cell RNA-Seq (scRNA-Seq) to profile 415,775 cells to show that organoid composition and development are comparable to human fetal and adult kidneys. Although cell classes were largely reproducible across iPSC lines, time points, protocols, and replicates, cell proportions were variable between different iPSC lines. Off-target cell proportions were the most variable. Prolonged in vitro culture did not alter cell types, but organoid transplantation under the mouse kidney capsule diminished off-target cells. Our work shows how scRNA-seq can help score organoids for reproducibility, faithfulness and quality, that kidney organoids derived from different iPSC lines are comparable surrogates for human kidney, and that transplantation enhances their formation by diminishing off-target cells.

Abstract Immune responses to cancer are highly variable, with mismatch repair-deficient (MMRd) tumors exhibiting more anti-tumor immunity than mismatch repair-proficient (MMRp) tumors. To understand the rules governing these varied responses, we transcriptionally profiled 371,223 cells from colorectal tumors and adjacent normal tissues of 28 MMRp and 34 MMRd patients. Analysis of 88 cell subsets and their 204 associated gene expression programs revealed extensive transcriptional and spatial remodeling across tumors. To discover hubs of interacting malignant and immune cells, we identified expression programs in different cell types that co-varied across patient tumors and used spatial profiling to localize coordinated programs. We discovered a myeloid cell-attracting hub at the tumor-luminal interface associated with tissue damage, and an MMRd-enriched immune hub within the tumor, with activated T cells together with malignant and myeloid cells expressing T-cell-attracting chemokines. By identifying interacting cellular programs, we thus reveal the logic underlying spatially organized immune-malignant cell networks.

Abstract Intrauterine growth restriction (IUGR) of fetuses affects 5-10% of pregnancies and is associated with perinatal morbidity, mortality and long-term health issues. Understanding genetic predisposition to IUGR is challenging, owing to extensive gene polymorphisms, linkage disequilibrium, and maternal and paternal influence. Here, we demonstrate that the inhibitory receptor, KIR2DL1, expressed on maternal uterine natural killer (uNK) cells, in interaction with the paternally-inherited HLA-C*05, an HLA-C group 2 allotype, expressed on fetal trophoblast cells, causes IUGR in a humanised mouse model. Micro-CT imaging of the uteroplacental vasculature revealed reduced uterine spiral artery diameter and increased segment length, increasing fetal blood flow resistance. Single cell RNA-Seq from the maternal-fetal interface highlighted expression programs activated by KIR2DL1-induced IUGR in several placental cell types, including degradation of extracellular matrix components, angiogenesis, and uNK cell communication, suggesting a complex response underlying IUGR. As current IUGR treatments are insufficient, our findings provide important insight for drug development.

The health of the kidney filtration barrier requires communication between podocytes, endothelial cells and mesangial cells. Disruption of these cell-cell interactions is thought to contribute to disease progression in chronic kidney diseases (CKD). We recently demonstrated that podocyte ablation via doxycycline-inducible deletion of an essential endogenous molecule, CTCF (iCTCFpod-/-), is sufficient to drive progressive CKD. However, the earliest events connecting podocyte injury to disrupted intercellular communication within the kidney filter remain unclear. Here we performed single-cell RNA sequencing of kidney tissue from iCTCFpod-/- mice after one week of doxycycline induction to generate a map of the earliest transcriptional effects of podocyte injury on cell-cell interactions at single cell resolution. A subset of podocytes showed the earliest signs of injury due to disrupted gene programs for cytoskeletal regulation and mitochondrial function. Surviving podocytes upregulated Col4a5, causing reactive changes in integrin expression in endothelial populations and mesangial cells. Intercellular interaction analysis revealed several receptor-ligand-target gene programs as drivers of endothelial cell injury and abnormal matrix deposition. This analysis reveals the earliest disruptive changes within the kidney filter, pointing to new, actionable targets within a therapeutic window that may allow us to maximize the success of much needed therapeutic interventions for CKD.