Abstract A year after the World Health Organisation (WHO) declared COVID-19 as a pandemic, much has been learned regarding SARS-CoV-2 epidemiology, vaccine production, and disease treatment. Whole-genome sequencing (WGS) has played a significant role in contributing to our understanding of the epidemiology and biology of this virus. In this paper, we investigate the use of SARS-CoV-2 WGS in Southeast and East Asia and the impact of technological development, access to resources, and demography of individual countries on its uptake. Using Oxford Nanopore Technology (ONT), Nottingham-Indonesia Collaboration for Clinical Research and Training (NICCRAT) initiative has facilitated collaboration between the University of Nottingham and a team in Research Centre for Biotechnology, Indonesian Institute of Sciences ( Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia/LIPI ) to carry out a small number of SARS-CoV-2 WGS in Indonesia. The ONT offers sequencing advantages that fit within the Indonesian context. Analyses of SARS-CoV-2 genomes deposited on GISAID from Southeast and East Asian countries reveal the importance of collecting clinical and demographic metadata and the importance of open access and data sharing. Lineage and phylogenetic analyses per 1 June 2021 found that: 1) B.1.466.2 variants were the most predominant in Indonesia, with mutations in the spike protein including D614G at 100%, N439K at 99.1%, and P681R at 69.7% frequency, 2) The variants of concern (VoCs) B.1.1.7 (Alpha), B.1.351 (Beta), and B.1.617.2 (Delta) were first detected in Indonesia in January 2021, 3) B.1.470 was first detected in Indonesia and spread to the neighbouring regions, and 4) The highest rate of virus transmissions between Indonesia and the rest of the world appears to be through interactions with Singapore and Japan, two neighbouring countries with a high degree of access and travels to and from Indonesia.

Abstract Polyploidy, the result of whole-genome duplication (WGD), is a major driver of eukaryote evolution. Yet WGDs are hugely disruptive mutations, and we still lack a clear understanding of their fitness consequences. Here, we study whether WGDs result in greater diversity of genomic structural variants (SVs) and how they influence evolutionary dynamics in a plant genus, Cochlearia (Brassicaceae). By using long-read sequencing and a graph-based pangenome, we find both negative and positive interactions between WGDs and SVs. Masking of recessive mutations due to WGDs leads to a progressive accumulation of deleterious SVs across four ploidal levels (from diploids to octoploids), likely reducing the adaptive potential of polyploid populations. However, we also discover putative benefits arising from SV accumulation, as more ploidy-specific SVs harbor signals of local adaptation in polyploids than in diploids. Together, our results suggest that SVs play diverse and contrasting roles in the evolutionary trajectories of young polyploids.

Abstract Summary MinoTour offers a LIMS system for Oxford Nanopore Technology (ONT) sequencers, with real-time metrics and analysis available permanently for review. Integration of unique real-time automated analysis can reduce the time required to answer biological questions, including mapping and classification of sequence whilst a run is in progress. Real-time sequence data requires new methods of analysis which do not wait for the completion of a run and MinoTour provides a framework to allow users to exploit these features. Availability and Implementation Source code and documentation are available at https://github.com/LooseLab/minotourcli and https://github.com/LooseLab/minotourapp . Docker images are available from https://hub.docker.com/r/adoni5/ , and can be installed using a preconfigured docker-compose script at https://github.com/LooseLab/minotour-docker . An example server is available at http://137.44.59.170 .

Abstract Motivation The ongoing SARS-CoV-2 pandemic has demonstrated the utility of real-time analysis of sequencing data, with a wide range of databases and resources for analysis now available. Here we show how the real-time nature of Oxford Nanopore Technologies sequencers can accelerate consensus generation, lineage and variant status assignment. We exploit the fact that multiplexed viral sequencing libraries quickly generate sufficient data for the majority of samples, with diminishing returns on remaining samples as the sequencing run progresses. We demonstrate methods to determine when a sequencing run has passed this point in order to reduce the time required and cost of sequencing. Results We extended MinoTour, our real-time analysis and monitoring platform for nanopore sequencers, to provide SARS-CoV2 analysis using ARTIC network pipelines. We additionally developed an algorithm to predict which samples will achieve sufficient coverage, automatically running the ARTIC medaka informatics pipeline once specific coverage thresholds have been reached on these samples. After testing on run data, we find significant run time savings are possible, enabling flow cells to be used more efficiently and enabling higher throughput data analysis. The resultant consensus genomes are assigned both PANGO lineage and variant status as defined by Public Health England. Samples from within individual runs are used to generate phylogenetic trees incorporating optional background samples as well as summaries of individual SNPs. As minoTour uses ARTIC pipelines, new primer schemes and pathogens can be added to allow minoTour to aid in real-time analysis of pathogens in the future. Availability and Implementation Source code and documentation is available at https://github.com/LooseLab/minotourapp . Supplementary information Supplementary data are available from https://github.com/LooseLab/artic_minotour_analyses .

Abstract Cell-fate decisions during mammalian gastrulation are poorly understood outside of rodent embryos. The embryonic disc of pig embryos mirrors humans, making them a useful proxy for studying gastrulation. Here we present a single-cell transcriptomic atlas of pig gastrulation, revealing cell-fate emergence dynamics, as well as conserved and divergent gene programs governing early porcine, primate, and murine development. We highlight heterochronicity in extraembryonic cell-types, despite the broad conservation of cell-type-specific transcriptional programs. We apply these findings in combination with functional investigations, to outline conserved spatial, molecular, and temporal events during definitive endoderm specification. We find early FOXA2 + /TBXT- embryonic disc cells directly form definitive endoderm, contrasting later-emerging FOXA2/TBXT+ node/notochord progenitors. Unlike mesoderm, none of these progenitors undergo epithelial-to-mesenchymal transition. Endoderm/Node fate hinges on balanced WNT and hypoblast-derived NODAL, which is extinguished upon endodermal differentiation. These findings emphasise the interplay between temporal and topological signalling in fate determination during gastrulation.

1 Abstract Summary Oxford Nanopore Technologies (ONT) sequencers enable real-time generation of sequence data, which allows for concurrent analysis during a run. Adaptive sampling leverages this real-time capability in extremis , rejecting or accepting reads for sequencing based on assessment of the sequence from the start of each read. This functionality is provided by ONT’s software, MinKNOW ( https://community.nanoporetech.com/downloads ). Designing and developing software to take advantage of adaptive sampling can be expensive due to the cost of using real sequencing consumables, using precious samples and preparing sequencing libraries. MinKNOW addresses this issue in part by providing the ability to replay previously sequenced runs for testing, using its playback functionality. However, as we have illustrated here, the sequencing output only partially changes in response to adaptive sampling instructions. Here we present Icarust, a tool enabling more accurate approximations of sequencing runs. Icarust recreates all the required endpoints of MinKNOW to perform adaptive sampling and writes output compatible with current base-callers and analysis pipelines. Icarust is capable of serving nanopore signal to simulate a MinION or PromethION flow cell experiment from any reference genome using either R9 or R10 pore signal. We show that simulating sequencing runs with Icarust provides a realistic testing and development environment for software exploiting the real-time nature of Nanopore sequencing. Availability and Implementation All code is open source and freely available here - https://github.com/LooseLab/Icarust . Icarust is implemented in Rust, with an easy to install and use docker container available. Supplementary Information Supplementary information is available here - https://github.com/Adoni5/Icarust_paper .

Abstract Early mammalian gastrulation’s cell-fate decisions are poorly understood due to difficulties obtaining non-rodent embryos. The bilaminar disc of pig embryos mirrors humans, making them a useful proxy for studying gastrulation. Here we present a single-cell transcriptomic atlas of pig gastrulation, revealing cell-fate emergence dynamics, as well as conserved and divergent gene programs governing early porcine, primate, and murine development. We highlight heterochronicity in extraembryonic cell-type development, despite the broad conservation of cell-type-specific transcriptional programs. We apply these findings in combination with functional investigations, to outline conserved spatial, molecular, and temporal events during definitive endoderm (DE). We find early FOXA2+/TBXT-embryonic disc cells directly from DE, contrasting later-emerging FOXA2/TBXT+ node/notochord progenitors. Unlike mesoderm, none of these progenitors undergo epithelial-to-mesenchymal transition. DE/Node fate hinges on balanced WNT and hypoblast-derived NODAL, which is extinguished upon DE differentiation. These findings emphasise the interplay between temporal and topological signalling in early fate decisions during gastrulation.

Genome sequencing has become a powerful tool for studying emerging infectious diseases; however, genome sequencing directly from clinical samples without isolation remains challenging for viruses such as Zika, where metagenomic sequencing methods may generate insufficient numbers of viral reads. Here we present a protocol for generating coding-sequence complete genomes comprising an online primer design tool, a novel multiplex PCR enrichment protocol, optimised library preparation methods for the portable MinION sequencer (Oxford Nanopore Technologies) and the Illumina range of instruments, and a bioinformatics pipeline for generating consensus sequences. The MinION protocol does not require an internet connection for analysis, making it suitable for field applications with limited connectivity. Our method relies on multiplex PCR for targeted enrichment of viral genomes from samples containing as few as 50 genome copies per reaction. Viral consensus sequences can be achieved starting with clinical samples in 1-2 days following a simple laboratory workflow. This method has been successfully used by several groups studying Zika virus evolution and is facilitating an understanding of the spread of the virus in the Americas.

Koala retrovirus (KoRV) is unique amongst endogenous (inherited) retroviruses in that its incorporation to the host genome is still active, providing an opportunity to study what drives this fundamental process in vertebrate genome evolution. RNA sequencing of KoRV from koala populations with high virus burden (Queensland) and low virus burden (South Australia) identified that South Australian animals, a population previously thought to have KoRV negative animals, harboured replication defective KoRV. This discovery provides the first evidence that a host population may maintain defective KoRV as protection from the infectious form of KoRV. This offers the intriguing prospect of being able to monitor and selectively breed for disease resistance to protect other wild koala populations from KoRV induced disease.

Abstract Polyploidy, the result of whole-genome duplication (WGD), is a major driver of eukaryote evolution. All angiosperms have undergone ancient WGDs, and today stable polyploids account for a substantial portion of both wild and domesticated plant species. Despite its centrality in evolution, WGD is a hugely disruptive mutation, and we still lack a clear understanding of its fitness consequences. Here, we study whether WGD results in greater diversity of genomic structural variants (SVs) and how this influences evolutionary dynamics in nature. Using a set of long-read sequenced samples from the plant genus Cochlearia (Brassicaceae), which contains diploids and a recent ploidy series up to octoploid, we show that masking of recessive mutations due to WGD has led to a substantial and progressive accumulation of genic SVs across four ploidy levels. Such SVs likely constitute a genetic load and thus reduce the adaptive potential of polyploid populations. However, this SV accumulation also provides a rich pool of standing genetic variation upon which selection may act in novel environments. By constructing a graph-based pangenome for Cochlearia , we identify SVs in hundreds of samples and study the genomic basis of environmental adaptation. We find putatively beneficial SVs involved in pathogen resistance, root development, and salt tolerance, many of which are unique to polyploids. Finally, we explore the adaptive landscapes of SVs and SNPs, identify geographical regions where SVs make novel contributions to adaptive variation, and predict that the role of SVs in environmental adaptation increases due to rapid climate change.