Abstract Analysis of human blood immune cells provides insights into the coordinated response to viral infections such as severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, which causes coronavirus disease 2019 (COVID-19). We performed single-cell transcriptome, surface proteome and T and B lymphocyte antigen receptor analyses of over 780,000 peripheral blood mononuclear cells from a cross-sectional cohort of 130 patients with varying severities of COVID-19. We identified expansion of nonclassical monocytes expressing complement transcripts ( CD16 + C1QA/B/C + ) that sequester platelets and were predicted to replenish the alveolar macrophage pool in COVID-19. Early, uncommitted CD34 + hematopoietic stem/progenitor cells were primed toward megakaryopoiesis, accompanied by expanded megakaryocyte-committed progenitors and increased platelet activation. Clonally expanded CD8 + T cells and an increased ratio of CD8 + effector T cells to effector memory T cells characterized severe disease, while circulating follicular helper T cells accompanied mild disease. We observed a relative loss of IgA2 in symptomatic disease despite an overall expansion of plasmablasts and plasma cells. Our study highlights the coordinated immune response that contributes to COVID-19 pathogenesis and reveals discrete cellular components that can be targeted for therapy.

Current computational workflows for comparative analyses of single-cell datasets typically use discrete clusters as input when testing for differential abundance among experimental conditions. However, clusters do not always provide the appropriate resolution and cannot capture continuous trajectories. Here we present Milo, a scalable statistical framework that performs differential abundance testing by assigning cells to partially overlapping neighborhoods on a k-nearest neighbor graph. Using simulations and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) data, we show that Milo can identify perturbations that are obscured by discretizing cells into clusters, that it maintains false discovery rate control across batch effects and that it outperforms alternative differential abundance testing strategies. Milo identifies the decline of a fate-biased epithelial precursor in the aging mouse thymus and identifies perturbations to multiple lineages in human cirrhotic liver. As Milo is based on a cell-cell similarity structure, it might also be applicable to single-cell data other than scRNA-seq. Milo is provided as an open-source R software package at https://github.com/MarioniLab/miloR .

Abstract The cellular landscape of the human intestinal tract is dynamic throughout life, developing in utero and changing in response to functional requirements and environmental exposures. Here, to comprehensively map cell lineages, we use single-cell RNA sequencing and antigen receptor analysis of almost half a million cells from up to 5 anatomical regions in the developing and up to 11 distinct anatomical regions in the healthy paediatric and adult human gut. This reveals the existence of transcriptionally distinct BEST4 epithelial cells throughout the human intestinal tract. Furthermore, we implicate IgG sensing as a function of intestinal tuft cells. We describe neural cell populations in the developing enteric nervous system, and predict cell-type-specific expression of genes associated with Hirschsprung’s disease. Finally, using a systems approach, we identify key cell players that drive the formation of secondary lymphoid tissue in early human development. We show that these programs are adopted in inflammatory bowel disease to recruit and retain immune cells at the site of inflammation. This catalogue of intestinal cells will provide new insights into cellular programs in development, homeostasis and disease.

Recent advances in single-cell technologies have enabled high-throughput molecular profiling of cells across modalities and locations. Single-cell transcriptomics data can now be complemented by chromatin accessibility, surface protein expression, adaptive immune receptor repertoire profiling and spatial information. The increasing availability of single-cell data across modalities has motivated the development of novel computational methods to help analysts derive biological insights. As the field grows, it becomes increasingly difficult to navigate the vast landscape of tools and analysis steps. Here, we summarize independent benchmarking studies of unimodal and multimodal single-cell analysis across modalities to suggest comprehensive best-practice workflows for the most common analysis steps. Where independent benchmarks are not available, we review and contrast popular methods. Our article serves as an entry point for novices in the field of single-cell (multi-)omic analysis and guides advanced users to the most recent best practices.

Single-cell genomics studies have decoded the immune cell composition of several human prenatal organs but were limited in describing the developing immune system as a distributed network across tissues. We profiled nine prenatal tissues combining single-cell RNA sequencing, antigen-receptor sequencing, and spatial transcriptomics to reconstruct the developing human immune system. This revealed the late acquisition of immune-effector functions by myeloid and lymphoid cell subsets and the maturation of monocytes and T cells before peripheral tissue seeding. Moreover, we uncovered system-wide blood and immune cell development beyond primary hematopoietic organs, characterized human prenatal B1 cells, and shed light on the origin of unconventional T cells. Our atlas provides both valuable data resources and biological insights that will facilitate cell engineering, regenerative medicine, and disease understanding.

Abstract Single-cell omic protocols applied to disease, development or mechanistic studies can reveal the emergence of aberrant cell states or changes in differentiation. These perturbations can manifest as a shift in the abundance of cells associated with a biological condition. Current computational workflows for comparative analyses typically use discrete clusters as input when testing for differential abundance between experimental conditions. However, clusters are not always an optimal representation of the biological manifold on which cells lie, especially in the context of continuous differentiation trajectories. To overcome these barriers to discovery, we present Milo , a flexible and scalable statistical framework that performs differential abundance testing by assigning cells to partially overlapping neighbourhoods on a k-nearest neighbour graph. Our method samples and refines neighbourhoods across the graph and leverages the flexibility of generalized linear models, making it applicable to a wide range of experimental settings. Using simulations, we show that Milo is both robust and sensitive, and can reveal subtle but important cell state perturbations that are obscured by discretizing cells into clusters. We illustrate the power of Milo by identifying the perturbed differentiation during ageing of a lineage-biased thymic epithelial precursor state and by uncovering extensive perturbation to multiple lineages in human cirrhotic liver. Milo is provided as an open-source R software package with documentation and tutorials at https://github.com/MarioniLab/miloR .

Abstract The cellular landscape of the human intestinal tract is dynamic throughout life, developing in utero and changing in response to functional requirements and environmental exposures. To comprehensively map cell lineages in the healthy developing, pediatric and adult human gut from ten distinct anatomical regions, as well as draining lymph nodes, we used singlecell RNA-seq and VDJ analysis of roughly one third of a million cells. This reveals the presence of BEST4+ absorptive cells throughout the human intestinal tract, demonstrating the existence of this cell type beyond the colon for the first time. Furthermore, we implicate IgG sensing as a novel function of intestinal tuft cells, and link these cells to the pathogenesis of inflammatory bowel disease. We define novel glial and neuronal cell populations in the developing enteric nervous system, and predict cell-type specific expression of Hirschsprung’s disease-associated genes. Finally, using a systems approach, we identify key cell players across multiple cell lineages driving secondary lymphoid tissue formation in early human development. We show that these programs are adopted in inflammatory bowel disease to recruit and retain immune cells at the site of inflammation. These data provide an unprecedented catalogue of intestinal cells, and new insights into cellular programs in development, homeostasis and disease.

Abstract We present a multiomic cell atlas of human lung development that combines single cell RNA and ATAC sequencing, high throughput spatial transcriptomics and single cell imaging. Coupling single cell methods with spatial analysis has allowed a comprehensive cellular survey of the epithelial, mesenchymal, endothelial and erythrocyte/leukocyte compartments from 5-22 post conception weeks. We identify new cell states in all compartments. These include developmental-specific secretory progenitors and a new subtype of neuroendocrine cell related to human small cell lung cancer. Our datasets are available through our web interface ( https://lungcellatlas.org ). Finally, to illustrate its general utility, we use our cell atlas to generate predictions about cell-cell signalling and transcription factor hierarchies which we test using organoid models. Highlights Spatiotemporal atlas of human lung development from 5-22 post conception weeks identifies 144 cell types/states. Tracking the developmental origins of multiple cell compartments, including new progenitor states. Functional diversity of fibroblasts in distinct anatomical signalling niches. Resource applied to interrogate and experimentally test the transcription factor code controlling neuroendocrine cell heterogeneity and the origins of small cell lung cancer.

Abstract Single cell genomics is a powerful tool to distinguish altered cell states in disease tissue samples, through joint analysis with healthy reference datasets. Collections of data from healthy individuals are being integrated in cell atlases that provide a comprehensive view of cellular phenotypes in a tissue. However, it remains unclear whether atlas datasets are suitable references for disease-state identification, or whether matched control samples should be employed, to minimise false discoveries driven by biological and technical confounders. Here we quantitatively compare the use of atlas and control datasets as references for identification of disease-associated cell states, on simulations and real disease scRNA-seq datasets. We find that reliance on a single type of reference dataset introduces false positives. Conversely, using an atlas dataset as reference for latent space learning followed by differential analysis against a matched control dataset leads to precise identification of disease-associated cell states. We show that, when an atlas dataset is available, it is possible to reduce the number of control samples without increasing the rate of false discoveries. Using a cell atlas of blood cells from 12 studies to contextualise data from a case-control COVID-19 cohort, we sensitively detect cell states associated with infection, and distinguish heterogeneous pathological cell states associated with distinct clinical severities. Our analysis provides guiding principles for design of disease cohort studies and efficient use of cell atlases within the Human Cell Atlas.