SUMMARY Molecular heterogeneities are a key feature of glioblastoma (GBM) pathology impeding patient’s stratification and leading to high discrepancies between patients mean survivals. Here, we established a molecular classification of GBM tumors using a pan-proteomic analysis. Then, we identified, from our proteomic data, 2 clusters of biomarkers associated with good or bad patient survival from 46 IDH wild-type GBMs. Three molecular groups have been identified and associated with systemic biology analyses. Group A tumors exhibit neurogenesis characteristics and tumorigenesis. Group B shows a strong immune cell signature and express poor prognosis markers while group C tumors are characterized by an anti-viral signature and tumor growth proteins. 124 proteins were found statistically different based on patient’s survival times, of which 10 are issued from alternative AltORF or non-coding RNA. After statistical analysis, a panel of markers associated to higher survival (PPP1R12A, RPS14, HSPD1 and LASP1) and another panel associated to lower survival (ALCAM, ANXA11, MAOB, IP_652563 and IGHM) has been validated by immunofluorescence. Taken together, our data will guide GBM prognosis and help to improve the current GBM classification by stratifying the patients and may open new opportunities for therapeutic development. Significance Glioblastoma are very heterogeneous tumors with median survivals usually inferior to 20 months. We conducted a pan-proteomics analysis of glioblastoma (GBM) in order to stratify GBM based on the molecular contained. Forty-six GBM cases were classified into three groups where proteins are involved in specific pathways i.e. the first group has a neurogenesis signature and is associated with a better prognosis while the second group of patients has an immune profile with a bad prognosis. The third group is more associated to tumorigenesis. We correlated these results with the TCGA data. Finally, we have identified 28 new prognostic markers of GBM and from these 28, a panel of 4 higher and 5 lower survival markers were validated. With these 9 markers in hand, now pathologist can stratify GBM patients and can guide the therapeutic decision. Highlights A novel stratification of glioblastoma based on mass spectrometry was established. Three groups with different molecular features and survival were identified. This new classification could improve prognostication and may help therapeutic options. 8 prognosis markers for oncologist therapeutic decision have been validated.

Early pathological upregulation of adenosine A2A receptors (A2ARs), one of the caffeine targets, by neurons is thought to be involved in the development of synaptic and memory deficits in Alzheimer's disease (AD) but mechanisms remain ill-defined. To tackle this question, we promoted a neuronal upregulation of A2AR in the hippocampus of APP/PS1 mice developing AD-like amyloidogenesis. Our findings revealed that the early upregulation of A2AR in the presence of an ongoing amyloid pathology exacerbates memory impairments of APP/PS1 mice. These behavioural changes were not linked to major change in the development of amyloid pathology but rather associated with increased phosphorylated tau at neuritic plaques. Moreover, proteomic and transcriptomic analyses coupled with quantitative immunofluorescence studies indicated that neuronal upregulation of the receptor promoted both neuronal and non-neuronal autonomous alterations, i.e. enhanced neuroinflammatory response but also loss of excitatory synapses and impaired neuronal mitochondrial function, presumably accounting for the detrimental effect on memory. Overall, our results provide compelling evidence that neuronal A2AR dysfunction, as seen in the brain of patients, contributes to amyloid-related pathogenesis and underscores the potential of A2AR as a relevant therapeutic target for mitigating cognitive impairments in this neurodegenerative disorder.

Abstract Mass Spectrometry Imaging (MSI) has shown to bring invaluable information for biological and clinical applications. However, conventional MSI is generally performed ex vivo from tissue sections. Here, we develop a novel MS-based method for in vivo mass spectrometry imaging. By coupling the SpiderMass technology - that provides in vivo minimally invasive analysis – to a robotic arm of high accuracy, we demonstrate that images can be acquired from any surface by moving the laser probe above the surface. By equipping the robotic arm with a sensor, we are also able to both get the topography image of the sample surface and the molecular distribution, and then and plot back the molecular data, directly to the 3D topographical image without the need for image fusion. This is shown for the first time with the 3D topographic MS-Based whole-body imaging of a mouse. Enabling fast in vivo MSI bridged to topography pave the way for surgical applications to excision margins.

3D tumoroids have revolutionized in vitro/ex vivo cancer biology by recapitulating the complex diversity of tumors. While tumoroids provide new insights into cancer development and treatment response, several limitations remain. As the tumor microenvironment, especially the immune system, strongly influences tumor development, the absence of immune cells in tumoroids may lead to inappropriate conclusions. Macrophages, key players in tumor progression, are particularly challenging to integrate into the tumoroids. In this study, we established three optimized and standardized methods for co-culturing human macrophages with breast cancer tumoroids: a semi-liquid model and two matrix-embedded models tailored for specific applications. We then tracked interactions and macrophage infiltration in these systems using flow cytometry and light sheet microscopy and showed that macrophages influenced not only tumoroid molecular profiles but also chemotherapy response. This underscores the importance of increasing the complexity of 3D models to more accurately reflect in vivo conditions.

There is growing interest in limiting the use of fungicides and implementing innovative, environmentally friendly strategies, such as the use of beneficial bacteria-triggered immunity, to protect grapevines from natural pathogens. Therefore, we need rapid and innovative ways to translate the knowledge of the molecular mechanisms underlying the activation of grapevine defenses against pathogens to induced resistance. Here, we have implemented an

In context of cancer diagnosis-based mass spectrometry (MS), the classification model created is crucial. Moreover, exploration of immune cell infiltration in tissues can offer insights within the tumor microenvironment. Here, we present a protocol to analyze 1D and 2D MS data from glioblastoma tissues for cancer diagnosis and immune cells identification. We describe steps for training the most optimal model and cross-validating it, for discovering robust biomarkers and obtaining their corresponding boxplots as well as creating an immunoscore based on MS-imaging data. For complete details on the use and execution of this protocol, please refer to Zirem et al.

Rapid and accurate clinical diagnosis of pathological conditions remains highly challenging. A very important component of diagnosis tool development is the design of effective classification models with Mass spectrometry (MS) data. Some popular Machine Learning (ML) approaches have been investigated for this purpose but these ML models require time-consuming preprocessing steps such as baseline correction, denoising, and spectrum alignment to remove non-sample-related data artifacts. They also depend on the tedious extraction of handcrafted features, making them unsuitable for rapid analysis. Convolutional Neural Networks (CNNs) have been found to perform well under such circumstances since they can learn efficient representations from raw data without the need for costly preprocessing. However, their effectiveness drastically decreases when the number of available training samples is small, which is a common situation in medical applications. Transfer learning strategies extend an accurate representation model learnt usually on a large dataset containing many categories, to a smaller dataset with far fewer categories. In this study, we first investigate transfer learning on a 1D-CNN we have designed to classify MS data, then we develop a new representation learning method when transfer learning is not powerful enough, as in cases of low-resolution or data heterogeneity. What we propose is to train the same model through several classification tasks over various small datasets in order to accumulate generic knowledge of what MS data are, in the resulting representation. By using rat brain data as the initial training dataset, a representation learning approach can have a classification accuracy exceeding 98% for canine sarcoma cancer cells, human ovarian cancer serums, and pathogenic microorganism biotypes in 1D clinical datasets. We show for the first time the use of cumulative representation learning using datasets generated in different biological contexts, on different organisms, in different mass ranges, with different MS ionization sources, and acquired by different instruments at different resolutions. Our approach thus proposes a promising strategy for improving MS data classification accuracy when only small numbers of samples are available as a prospective cohort. The principles demonstrated in this work could even be beneficial to other domains (astronomy, archaeology...) where training samples are scarce.

Abstract Breast cancer is the most frequent cancer among women causing the greatest number of cancer-related deaths. Cancer heterogeneity is a main obstacle to therapies. Around 96% of the drugs fail from discovery to the clinical trial phase probably because of the current unreliable preclinical models. New models emerge such as companion dogs who develop spontaneous mammary tumors resembling human breast cancer in many clinical and molecular aspects. The present work aimed at developing a robust canine mammary tumor model in the form of tumoroids which recapitulate the tumor diversity and heterogeneity. We conducted a complete characterization of these canine mammary tumoroids through histologic, molecular and proteomic analysis, demonstrating their strong similarity to the primary tumor. We demonstrated that these tumoroids can be used as a drug screening model. In fact, we showed that Paclitaxel, a human chemotherapeutic, could killed canine tumoroids with the same efficacy as human tumoroids with 0.1 to 1 μM of drug needed to kill 50% of the cells. Due to easy tissue availability, canine tumoroids can be produced at larger scale and cryopreserved to constitute a biobank. We have demonstrated that cryopreserved tumoroids keep the same histologic and molecular features (ER, PR and HER2 expression) as fresh tumoroids. Two techniques of cryopreservation were compared demonstrating that tumoroids made from frozen tumor material allowed to maintain a higher molecular diversity. These findings revealed that canine mammary tumoroids can be easily generated at large scale and can represent a more reliable preclinical model to investigate tumorigenesis mechanisms and develop new treatments for both veterinary and human medicine.

ABSTRACT Ovarian cancer is the leading cause of death from gynecologic cancer worldwide; however, the origin of ovarian tumors, particularly for high-grade serous carcinoma (HGSC), is still debated. Accumulated evidence converges towards the involvement of the preneoplastic lesions observed in the fimbriated end of the fallopian tubes. In this study, we propose to carry out an in-depth proteomics analysis of these epithelial lesions (p53 signature, serous tubal intraepithelial carcinoma-STIC and serous tubal intraepithelial lesions-STIL) based on spatially resolved proteomic guided by IHC technique. We identified specific clusters related to each preneoplastic lesions, specific protein mutations based on Cosmic database and a Ghost proteome translated from non-coding RNAs and alternative ORFs, using the OpenProt database. Protein networks have been constructed from each cluster utilizing systems biology platform. Generated data were used to confirm the potentially dormant character of the STIL lesion and the more aggressive profile of the STIC which appears closer to HGSC than other lesions. In summary, our results established the chronological mechanisms and genesis of different ovarian cancer phenotypes but also identified the early diagnostic markers of HCSC guiding an adapted therapy and a better patient care.

ABSTRACT Intratumoral bacteria locally contribute to cellular and molecular tumor heterogeneity that support cancer stemness through poorly understood mechanisms. This study aims to explore how Colibactin-producing Escherichia coli (CoPEC) flexibly alters the tumor microenvironment in right-sided colorectal cancer (CRC). Metabolomic and transcriptomic spatial profiling uncovered that CoPEC colonization establishes a high-glycerophospholipid microenvironment within the tumor that is conducive to exhaustion of infiltrated CD8 + T cell and has a lowered prognostic value in right-sided CRC. Mechanistically, the accumulation of lipid droplets in infected cancer cells relied on the production of colibactin as a measure to limit genotoxic stress and supply with sufficient energy for sustaining cell survival and lowering tumor immunogenicity. Specifically, a heightened phosphatidylcholine remodeling of CoPEC-infected cancer cells by the enzyme of the Land’s cycle coincided with a lowered accumulation of proapoptotic ceramide and lysophosphatidylcholine. Consequently, a reduced infiltration of CD8 + T lymphocytes that produce the cytotoxic cytokines IFN-γ was found where invading bacteria have been geolocated. By contrast, such an immunosuppressive dysmetabolic process was not observed when human colon cancer cells were infected with the mutant strain that did not produce colibactin (11G5δClbQ). This work revealed an unexpected property of CoPEC on lipid overload within tumors that could locally provide an inflammatory environment leading to immunosuppressive mechanisms and tumor expansion. This may pave the way for improving chemoresistance and subsequently outcome of CRC patients who are colonized by CoPEC.