The conserved transcriptional regulator heat shock factor 1 (Hsf1) is a key sensor of proteotoxic and other stress in the eukaryotic cytosol. We surveyed Hsf1 activity in a genome-wide loss-of-function library in Saccaromyces cerevisiae as well as ∼78,000 double mutants and found Hsf1 activity to be modulated by highly diverse stresses. These included disruption of a ribosome-bound complex we named the Ribosome Quality Control Complex (RQC) comprising the Ltn1 E3 ubiquitin ligase, two highly conserved but poorly characterized proteins (Tae2 and Rqc1), and Cdc48 and its cofactors. Electron microscopy and biochemical analyses revealed that the RQC forms a stable complex with 60S ribosomal subunits containing stalled polypeptides and triggers their degradation. A negative feedback loop regulates the RQC, and Hsf1 senses an RQC-mediated translation-stress signal distinctly from other stresses. Our work reveals the range of stresses Hsf1 monitors and elucidates a conserved cotranslational protein quality control mechanism.

DMS-MaPseq enables genome-wide and target-specific RNA secondary structure probing of even rare or heterogeneously structured RNAs in vivo and was used to study structure involved in translation regulation as well as nascent transcripts. Coupling of structure-specific in vivo chemical modification to next-generation sequencing is transforming RNA secondary structure studies in living cells. The dominant strategy for detecting in vivo chemical modifications uses reverse transcriptase truncation products, which introduce biases and necessitate population-average assessments of RNA structure. Here we present dimethyl sulfate (DMS) mutational profiling with sequencing (DMS-MaPseq), which encodes DMS modifications as mismatches using a thermostable group II intron reverse transcriptase. DMS-MaPseq yields a high signal-to-noise ratio, can report multiple structural features per molecule, and allows both genome-wide studies and focused in vivo investigations of even low-abundance RNAs. We apply DMS-MaPseq for the first analysis of RNA structure within an animal tissue and to identify a functional structure involved in noncanonical translation initiation. Additionally, we use DMS-MaPseq to compare the in vivo structure of pre-mRNAs with their mature isoforms. These applications illustrate DMS-MaPseq's capacity to dramatically expand in vivo analysis of RNA structure.

Abstract Ribosome profiling data report on the distribution of translating ribosomes, at steady‐state, with codon‐level resolution. We present a robust method to extract codon translation rates and protein synthesis rates from these data, and identify causal features associated with elongation and translation efficiency in physiological conditions in yeast. We show that neither elongation rate nor translational efficiency is improved by experimental manipulation of the abundance or body sequence of the rare AGG tRNA . Deletion of three of the four copies of the heavily used ACA tRNA shows a modest efficiency decrease that could be explained by other rate‐reducing signals at gene start. This suggests that correlation between codon bias and efficiency arises as selection for codons to utilize translation machinery efficiently in highly translated genes. We also show a correlation between efficiency and RNA structure calculated both computationally and from recent structure probing data, as well as the Kozak initiation motif, which may comprise a mechanism to regulate initiation.

Abstract The COVID-19 pandemic is exacting an increasing toll worldwide, with new SARS-CoV-2 variants emerging that exhibit higher infectivity rates and that may partially evade vaccine and antibody immunity 1 . Rapid deployment of non-invasive therapeutic avenues capable of preventing infection by all SARS-CoV-2 variants could complement current vaccination efforts and help turn the tide on the COVID-19 pandemic 2 . Here, we describe a novel therapeutic strategy targeting the SARS-CoV-2 RNA using locked nucleic acid antisense oligonucleotides (LNA ASOs). We identified an LNA ASO binding to the 5’ leader sequence of SARS-CoV-2 ORF1a/b that disrupts a highly conserved stem-loop structure with nanomolar efficacy in preventing viral replication in human cells. Daily intranasal administration of this LNA ASO in the K18-hACE2 humanized COVID-19 mouse model potently (98-99%) suppressed viral replication in the lungs of infected mice, revealing strong prophylactic and treatment effects. We found that the LNA ASO also represses viral infection in golden Syrian hamsters, and is highly efficacious in countering all SARS-CoV-2 “variants of concern” tested in vitro and in vivo , including B.1.427, B.1.1.7, and B.1.351 variants 3 . Hence, inhaled LNA ASOs targeting SARS-CoV-2 represents a promising therapeutic approach to reduce transmission of variants partially resistant to vaccines and monoclonal antibodies, and could be deployed intranasally for prophylaxis or via lung delivery by nebulizer to decrease severity of COVID-19 in infected individuals. LNA ASOs are chemically stable and can be flexibly modified to target different viral RNA sequences 4 , and they may have particular impact in areas where vaccine distribution is a challenge, and could be stockpiled for future coronavirus pandemics.

Abstract Combinatorially, intron excision within a given nascent transcript could proceed down any of thousands of paths, each of which would expose different dynamic landscapes of cis-elements and contribute to alternative splicing. In this study, we found that post-transcriptional multi-intron splicing order in human cells is largely predetermined, with most genes spliced in one or a few predominant orders. Strikingly, these orders were conserved across cell types and stages of motor neuron differentiation. Introns flanking alternatively spliced exons were frequently excised last, after their neighboring introns. Perturbations to the spliceosomal U2 snRNA altered the preferred splicing order of many genes, and these alterations were associated with the retention of other introns in the same transcript. In one gene, early removal of specific introns was sufficient to induce delayed excision of three proximal introns, and this delay was caused by two distinct cis-regulatory mechanisms. Together, our results demonstrate that multi-intron splicing order in human cells is predetermined, is influenced by a component of the spliceosome, and ensures splicing fidelity across long pre-mRNAs.

The human mitochondrial genome encodes crucial oxidative phosphorylation system proteins, pivotal for aerobic energy transduction. They are translated from nine monocistronic and two bicistronic transcripts whose native structures remain unexplored, posing a gap in understanding mitochondrial gene expression. In this work, we devised the mitochondrial dimethyl sulfate mutational profiling with sequencing (mitoDMS-MaPseq) method and applied detection of RNA folding ensembles using expectation-maximization (DREEM) clustering to unravel the native mitochondrial messenger RNA (mt-mRNA) structurome in wild-type (WT) and leucine-rich pentatricopeptide repeat–containing protein (LRPPRC)–deficient cells. Our findings elucidate LRPPRC’s role as a holdase contributing to maintaining mt-mRNA folding and efficient translation. mt-mRNA structural insights in WT mitochondria, coupled with metabolic labeling, unveil potential mRNA-programmed translational pausing and a distinct programmed ribosomal frameshifting mechanism. Our data define a critical layer of mitochondrial gene expression regulation. These mt-mRNA folding maps provide a reference for studying mt-mRNA structures in diverse physiological and pathological contexts.

Abstract Outer membrane porins in Gram-negative bacteria facilitate antibiotic influx. In Klebsiella pneumoniae (KP), modifications in the porin OmpK36 are implicated in increasing resistance to carbapenems. Analysis of large KP genome collections, encompassing major healthcare-associated clones, revealed the recurrent emergence of a synonymous cytosine to thymine transition at position 25 (25c>t) in ompK36. We show that the 25c>t transition increases carbapenem resistance through depletion of OmpK36 from the outer membrane. The mutation attenuates KP in a murine pneumonia model, which accounts for its limited clonal expansion observed by phylogenetic analysis. However, in the context of carbapenem treatment, the 25c>t transition tips the balance towards treatment failure, thus accounting for its recurrent emergence. Mechanistically, the 25c>t transition mediates an intramolecular mRNA interaction between a uracil encoded by 25t and the first adenine within the Shine-Dalgarno sequence. This specific interaction leads to the formation of an RNA stem structure, which obscures the ribosomal binding site thus disrupting translation. While mutations reducing OmpK36 expression via transcriptional silencing are known, we uniquely demonstrate the repeated selection of a synonymous ompK36 mutation mediating translational suppression in response to antibiotic pressure.