Transcription factors (TFs) and their specific interactions with targets are crucial for specifying gene-expression programs. To gain insights into the transcriptional regulatory networks in embryonic stem (ES) cells, we use chromatin immunoprecipitation coupled with ultra-high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) to map the locations of 13 sequence-specific TFs (Nanog, Oct4, STAT3, Smad1, Sox2, Zfx, c-Myc, n-Myc, Klf4, Esrrb, Tcfcp2l1, E2f1, and CTCF) and 2 transcription regulators (p300 and Suz12). These factors are known to play different roles in ES-cell biology as components of the LIF and BMP signaling pathways, self-renewal regulators, and key reprogramming factors. Our study provides insights into the integration of the signaling pathways into the ES-cell-specific transcription circuitries. Intriguingly, we find specific genomic regions extensively targeted by different TFs. Collectively, the comprehensive mapping of TF-binding sites identifies important features of the transcriptional regulatory networks that define ES-cell identity.

The ability to derive a whole-genome map of transcription-factor binding sites (TFBS) is crucial for elucidating gene regulatory networks. Herein, we describe a robust approach that couples chromatin immunoprecipitation (ChIP) with the paired-end ditag (PET) sequencing strategy for unbiased and precise global localization of TFBS. We have applied this strategy to map p53 targets in the human genome. From a saturated sampling of over half a million PET sequences, we characterized 65,572 unique p53 ChIP DNA fragments and established overlapping PET clusters as a readout to define p53 binding loci with remarkable specificity. Based on this information, we refined the consensus p53 binding motif, identified at least 542 binding loci with high confidence, discovered 98 previously unidentified p53 target genes that were implicated in novel aspects of p53 functions, and showed their clinical relevance to p53-dependent tumorigenesis in primary cancer samples.

Nanog, Sox2, and Oct4 are transcription factors all essential to maintaining the pluripotent embryonic stem cell phenotype. Through a cooperative interaction, Sox2 and Oct4 have previously been described to drive pluripotent-specific expression of a number of genes. We now extend the list of Sox2-Oct4 target genes to include Nanog. Within the Nanog proximal promoter, we identify a composite sox-oct cis-regulatory element essential for Nanog pluripotent transcription. This element is conserved over 250 million years of cumulative evolution within the eutherian mammals. A Nanog proximal promoter-EGFP (enhanced green fluorescent protein) reporter transgene recapitulates endogenous Nanog mRNA expression in embryonic stem cells and their differentiated derivatives. Sox2 and Oct4 interaction with the Nanog promoter was confirmed through mutagenesis and in vitro binding assays. Electrophoretic mobility shift assays indicate that the Sox2-Oct4 heterodimer forms more efficiently on the composite element within Nanog than the similar element within Fgf4. Using chromatin immunoprecipitation, we show that Oct4 and Sox2 bind to the Nanog promoter in living mouse and human embryonic stem cells. Furthermore, by specific knockdown of Oct4 and Sox2 mRNA by RNA interference in embryonic stem cells, we provide genetic evidence for a link between Oct4, Sox2, and the Nanog promoter. These studies extend the understanding of the pluripotent genetic regulatory network within which the Sox2-Oct4 complex are at the top of the regulatory hierarchy. Nanog, Sox2, and Oct4 are transcription factors all essential to maintaining the pluripotent embryonic stem cell phenotype. Through a cooperative interaction, Sox2 and Oct4 have previously been described to drive pluripotent-specific expression of a number of genes. We now extend the list of Sox2-Oct4 target genes to include Nanog. Within the Nanog proximal promoter, we identify a composite sox-oct cis-regulatory element essential for Nanog pluripotent transcription. This element is conserved over 250 million years of cumulative evolution within the eutherian mammals. A Nanog proximal promoter-EGFP (enhanced green fluorescent protein) reporter transgene recapitulates endogenous Nanog mRNA expression in embryonic stem cells and their differentiated derivatives. Sox2 and Oct4 interaction with the Nanog promoter was confirmed through mutagenesis and in vitro binding assays. Electrophoretic mobility shift assays indicate that the Sox2-Oct4 heterodimer forms more efficiently on the composite element within Nanog than the similar element within Fgf4. Using chromatin immunoprecipitation, we show that Oct4 and Sox2 bind to the Nanog promoter in living mouse and human embryonic stem cells. Furthermore, by specific knockdown of Oct4 and Sox2 mRNA by RNA interference in embryonic stem cells, we provide genetic evidence for a link between Oct4, Sox2, and the Nanog promoter. These studies extend the understanding of the pluripotent genetic regulatory network within which the Sox2-Oct4 complex are at the top of the regulatory hierarchy. Nanog is a homeobox-containing transcription factor with an essential function in maintaining the pluripotent cells of the inner cell mass and in the derivation of embryonic stem cells (ESCs) 1The abbreviations used are: ESC, embryonic stem cell; EMSA, electrophoretic mobility shift assay; GFP, green fluorescent protein; EGFP, enhanced GFP; RA, retinoic acid; RNAi, RNA interference; LIF, leukemia inhibitory factor; FACS, fluorescence-activated cell sorting; ChIP, chromatin immunoprecipitation; ES, embryonic stem; PSBP, pluripotent cell-specific Sox element-binding protein. from these (1Mitsui K. Tokuzawa Y. Itoh H. Segawa K. Murakami M. Takahashi K. Maruyama M. Maeda M. Yamanaka S. Cell. 2003; 113: 631-642Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2604) Google Scholar). Furthermore, overexpression of Nanog is capable of maintaining the pluripotency and self-renewing characteristics of ESCs under what normally would be differentiation-inducing culture conditions (2Chambers I. Colby D. Robertson M. Nichols J. Lee S. Tweedie S. Smith A. Cell. 2003; 113: 643-655Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2678) Google Scholar). Concomitant with this essential function in pluripotent cell maintenance is its restricted expression pattern. Nanog transcripts first appear in the inner cells of the morula prior to blastocyst formation (1Mitsui K. Tokuzawa Y. Itoh H. Segawa K. Murakami M. Takahashi K. Maruyama M. Maeda M. Yamanaka S. Cell. 2003; 113: 631-642Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2604) Google Scholar, 2Chambers I. Colby D. Robertson M. Nichols J. Lee S. Tweedie S. Smith A. Cell. 2003; 113: 643-655Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2678) Google Scholar), are restricted to the inner cell mass in the blastocyst (3Wang S.H. Tsai M.S. Chiang M.F. Li H. Gene Expr. Patterns. 2003; 3: 99-103Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar), and are no longer detectable at implantation. Expression of Nanog reappears in the proximal epiblast at embryonic day 6 and remains restricted to the epiblast as development progresses (4Hart A.H. Hartley L. Ibrahim M. Robb L. Dev. Dyn. 2004; 230: 187-198Crossref PubMed Scopus (277) Google Scholar). The factors controlling expression of this gene have yet to be described. The POU domain-containing Oct4 and the HMG domain-containing Sox2 are two other transcription factors known to be essential for normal pluripotent cell development and maintenance (5Nichols J. Zevnik B. Anastassiadis K. Niwa H. Klewe-Nebenius D. Chambers I. Schöler H. Smith A. Cell. 1998; 95: 379-391Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2703) Google Scholar, 6Avilion A.A. Nicolis S.K. Pevny L.H. Perez L. Vivian N. Lovell-Badge R. Genes Dev. 2003; 17: 126-140Crossref PubMed Scopus (1824) Google Scholar). Although both have independent roles in determining other cell types (6Avilion A.A. Nicolis S.K. Pevny L.H. Perez L. Vivian N. Lovell-Badge R. Genes Dev. 2003; 17: 126-140Crossref PubMed Scopus (1824) Google Scholar, 7Niwa H. Miyazaki J. Smith A.G. Nat. Genet. 2000; 24: 372-376Crossref PubMed Scopus (2926) Google Scholar), at least part of their function in pluripotent cells is via a synergistic interaction between the two to drive transcription of target genes. Currently known targets of Sox2-Oct4 synergy are Fgf4, Utf1, and Fbx15, as well as Sox2 and Pou5f1 (the gene encoding Oct4) themselves (8Yuan H. Corbi N. Basilico C. Dailey L. Genes Dev. 1995; 9: 2635-2645Crossref PubMed Scopus (643) Google Scholar, 9Nishimoto M. Fukushima A. Okuda A. Muramatsu M. Mol. Cell. Biol. 1999; 19: 5453-5465Crossref PubMed Scopus (311) Google Scholar, 10Tokuzawa Y. Kaiho E. Maruyama M. Takahashi K. Mitsui K. Maeda M. Niwa H. Yamanaka S. Mol. Cell. Biol. 2003; 23: 2699-2708Crossref PubMed Scopus (221) Google Scholar, 11Tomioka M. Nishimoto M. Miyagi S. Katayanagi T. Fukui N. Niwa H. Muramatsu M. Okuda A. Nucleic Acids Res. 2002; 30: 3202-3213Crossref PubMed Scopus (249) Google Scholar, 12Chew J-L. Loh Y.-H. Zhang W. Chen X. Tam W.-L. Yeap L.-S. Li P. Ang Y.-S. Lim B. Robson P. Ng H.-H. Mol. Cell. Biol. 2005; (in press)Google Scholar, 13Okumura-Nakanishi S. Saito M. Niwa H. Ishikawa F. J. Biol. Chem. 2005; 280: 5307-5317Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (316) Google Scholar). Each of these target genes has a composite element containing an octamer and a sox binding site. Our recent characterization of a genetic link between the Sox2-Oct4 complex and Sox2 and Pou5f1 expression, as well as their in vivo binding to these genes in mouse and human ESCs (12Chew J-L. Loh Y.-H. Zhang W. Chen X. Tam W.-L. Yeap L.-S. Li P. Ang Y.-S. Lim B. Robson P. Ng H.-H. Mol. Cell. Biol. 2005; (in press)Google Scholar), suggests that this complex is at the top of the pluripotent cell genetic regulatory network. In this study, we were interested in identifying the cis-regulatory module responsible for the pluripotent-specific expression of Nanog. Nanog represents the first known transcription factor appearing after compaction, and specific to the inner cells of the morula, both Oct4 and Sox2 are expressed prior to compaction in all blastomeres (6Avilion A.A. Nicolis S.K. Pevny L.H. Perez L. Vivian N. Lovell-Badge R. Genes Dev. 2003; 17: 126-140Crossref PubMed Scopus (1824) Google Scholar, 14Palmieri S.L. Peter W. Hess H. Schöler H.R. Dev. Biol. 1994; 166: 259-267Crossref PubMed Scopus (529) Google Scholar). As the expression of Nanog precisely corresponds to the pluripotent phenotype, we reasoned that a molecular understanding of the regulation of this gene would provide further insight into pluripotency. Here we describe a cis-regulatory module conserved throughout the eutherian mammals that is capable of recapitulating endogenous Nanog expression; at the core of this module is a composite oct-sox element necessary for pluripotent expression. Sequence Analysis and Promoter Constructs—All sequences were from public data bases at www.ncbi.nlm.nih.gov and/or www.ensembl.org. A genomic sequence corresponding to Homo sapiens NANOG (15Booth H.A. Holland P.W. Genomics. 2004; 84: 229-238Crossref PubMed Scopus (115) Google Scholar) was used. Bos taurus (cow) and Loxodonta africana (elephant) sequences were constructed from trace files available at NCBI. Mus musculus (mouse) and Rattus norvegicus (rat) sequences were from the respective compiled genomic sequences. The promoter region of mouse Nanog was amplified from genomic DNA. Primers for amplification, with restriction sites for cloning purposes indicated in lowercase, were: forward, 5′-CGCgtcgacTAAAGTGAAATGAGGTAAAGCC-3′, and reverse, 5′-CGCggatccGGAAAGATCATAGAAAGAAGAG-3′. The amplified product was cloned into pGL3-Basic (Promega) and pEGFP1 (Clontech) vectors and sequence-verified. Embryonic Stem Cell Culture and Reporter Lines—E14 mouse ESCs were grown in Dulbecco's modified Eagle's medium, 20% fetal bovine serum, 1× non-essential amino acids, 0.1 mm 2-mercaptoethanol, and an aliquot of recombinant LIF conditioned medium. ESCs were stably transfected with the NanogEGFP construct using a standard protocol, and individual colonies were picked after selection with 300 μg/ml G418 for 10 days with cells grown on neomycin-resistant mouse embryonic fibroblasts. Differentiation of ESCs was by withdrawal of LIF-conditioned medium, spontaneous differentiation into embryoid bodies, or the addition of retinoic acid. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) was on a FACSCalibur (BD Biosciences). Quantitation of endogenous Nanog and enhanced green fluorescent protein (EGFP) reporter expression was by reverse transcription-PCR analyses in real time using the ABI PRISM 7900 sequence detection system (Applied Biosystems). Proligo-synthesized primer-probe sets for these were as follows: Nanog forward, 5′-GGTTGAAGACTAGCAATGGTCTGA-3′; Nanog reverse, 5′-TGCAATGGATGCTGGGATACTC-3′; Nanog probe, 5′-TTCAGAAGGGCTCAGCACCA-3′; EGFP forward, 5′-CGACAACCACTACCTGAGCAC-3′; EGFP reverse, 5′-TCGTCCATGCCGAGAGTGAT-3′; EGFP probe, 5′-CGGCGGCGGTCACGAACTCCAGC-3′. Expression was normalized to a β-actin control (Applied Biosystems). The human ESC line HUES-6 (obtained from Doug Melton, Harvard University) was passaged according to Cowan et al. (16Cowan C.A. Klimanskaya I. McMahon J. Atienza J. Witmyer J. Zucker J.P. Wang S. Morton C.C. McMahon A.P. Powers D. Melton D.A. N. Engl. J. Med. 2004; 350: 1353-1356Crossref PubMed Scopus (832) Google Scholar). Luciferase Reporter Assays—F9 cells (ATCC) were cultured in Dul-becco's modified Eagle's medium with high glucose (Invitrogen), 15% standard fetal bovine serum (Hyclone), and 1% penicillin/streptomycin and maintained at 37 °C with 5% CO2. DNA transfection was by Lipofectamine 2000 (Invitrogen) following the supplied protocol. A Renilla luciferase plasmid (pRL-TK from Promega) was co-transfected as an internal control. Cells were harvested after 24 h, and the luciferase activity of the lysate was measured with the Dual-Luciferase reporter assay system (Promega) using the Centro LB960 96-well luminometer (Berthold Technologies). At a minimum, transfections were done in duplicate and on two independent occasions. Reporter plasmids were modified using the Transformer site-directed mutagenesis kit (Clontech) to incorporate 3-bp mutations which were subsequently verified by sequencing. Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA)—Nuclear extracts were prepared from E14 mouse ESCs grown on mouse embryonic fibroblast feeders using the method of Dignam et al. (17Dignam J.D. Lebovitz R.M. Roeder R.G. Nucleic Acids Res. 1983; 11: 1475-1489Crossref PubMed Scopus (9164) Google Scholar) with modifications as described. Cells were washed and harvested by scraping in phosphate-buffered saline, resuspended in 5 pellet volumes of buffer A (10 mm Hepes, pH 7.9, 1.5 mm MgCl2,10mm KCl, 0.5 mm dithiothreitol, 1% protease inhibitor mixture (Sigma)), and incubated on ice for 10 min. Cells were resuspended in 2 pellet volumes of buffer A and lysed with a Dounce homogenizer. Pelleted nuclei were resuspended in 0.6 pellet volumes of buffer C (20 mm Hepes, pH 7.9, 25% glycerol, 420 mm NaCl, 1.5 mm MgCl2, 0.2 mm EDTA, 0.5 mm dithiothreitol, 1% protease inhibitor mixture) and incubated at 4 °C with rotation for 30 min. After centrifugation supernatants were dialyzed against dialysis buffer (20 mm Hepes, pH 7.9, 20% glycerol, 100 mm KCl, 0.83 mm EDTA, 1.66 mm dithiothreitol, 1% protease inhibitor mixture) at 4 °C for 2 h. Extracts were then stored at -80 °C. For EMSA, double-stranded DNA oligonucleotides (Proligo) labeled with cy5 at the 5′ termini of both strands were used. Sense strand sequences were as follows: FOS, 5′-TTTAAGTATCCCATTAGCATCCAAACAAAGAGTTTTC-3′; NOS, 5′-CTTACAGCTTCTTTTGCATTACAATGTCCATGGTGGA-3′, NmOS, 5′-CTTACAGCTTCTTTCAAATTACAATGTCCATGGTGGA-3′; NOmS, 5′-CTTACAGCTTCTTTTGCATTAACCTGTCCATGGTGGA-3′; NmOmS, 5′-CTTACAGCTTCTTTCAAATTAACCTGTCCATGGTGGA-3′; NNS, 5′-CTGCAGGTGGGATTAACTGTGAATTCA-3′. For DNA binding reactions, 2 μl (∼16 μg) of nuclear extract was added to a 10-μl reaction (final) containing 50 nm cy5 oligonucleotide and 5 μg of poly(dGdC) (Amersham Biosciences). The final binding buffer composition was 60% dialysis buffer. Where specified, 1 μm unlabeled double-stranded competitor was also included prior to the addition of nuclear extracts. Binding reactions were incubated for 20 min at room temperature. Where specified, antibodies (Santa Cruz Biotechnology) were added after the initial incubation for a further 20 min as follows: 2 μl of anti-Oct4 (sc-9081x) and anti-JunB (sc-46x) or 8 μl of anti-Sox2 (sc-17320) and anti-Sox4 (sc-17326). Binding reactions were resolved on pre-run 6% native PAGE gels (18.5 × 20 cm) in 0.5× Tris-borate-EDTA for 2 h at 300 V. Gels were imaged directly in glass plates using an Amersham Biosciences Typhoon 9140 PhosphorImager. EMSA performed with mouse embryonic fibroblast feeders alone produced no significant mobility shifts, indicating that they did not contribute to the observed protein-DNA complexes. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assay—ChIP assays with E14 mouse ESCs were carried out as described (18Wells J. Farnham P.J. Methods (Orlando). 2002; 26: 48-56Google Scholar). Briefly, cells were cross-linked with 1% formaldehyde for 10 min at room temperature, and formaldehyde was inactivated by the addition of 125 mm glycine. Chromatin extracts containing DNA fragments with an average size of 500 bp were immunoprecipitated using Oct4 (N19) or Sox2 (Y17) polyclonal antibodies (Santa Cruz Biotechnology) or a Sox2 (AB5603) polyclonal antibody (Chemicon). For all ChIP experiments, quantitative PCR analyses were performed in real time using the ABI PRISM 7900 sequence detection system (Applied Biosystems) and SYBR Green master mix (Applied Biosystems) as described (19Ng H.H. Robert F. Young R.A. Struhl K. Mol. Cell. 2003; 11: 709-719Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (857) Google Scholar). Relative occupancy values were calculated by determining the apparent immunoprecipitate efficiency (ratios of the amount of immunoprecipitated DNA over that of the input sample) and normalized to the level observed at a control region, which was defined as 1.0. Primer pairs were as follows: 1, 5′-GGCAAACTTTGAACTTGGGATGTGGAAATA-3′, 5′-CTCAGCCGTCTAAGCAATGGAAGAAGAAAT-3′; 2, 5′-GAGGATGCCCCCTAAGCTTTCCCTCCC-3′, 5′-CCTCCTACCCTACCCACCCCCTATTCTCCC-3′; 3, 5′-GGGTCACCTTACAGCTTCTTTTGCATTA-3′, 5′-GGCTCAAGGCGATAGATTTAAAGGGTAG-3′; 4, 5′-GGTGATACGTTGGCCTTCTAGTCTGAA-3′, 5′-GGGCAAATTGCAAACTAACTGTATAACCTC-3′. RNAi Analysis—E14 mouse ESCs were seeded into 96-well plates at 20,000–30,000 cells/well density (with primary embryonic fibroblasts at 1000 cells/well) 1 day prior to transfection. Transfection was performed with Lipofectamine 2000. 50 ng of Nanog-pGL3 (firefly luciferase construct), 150 ng of pSuper or pSuper_RNAi (for further details, see Ref. 12Chew J-L. Loh Y.-H. Zhang W. Chen X. Tam W.-L. Yeap L.-S. Li P. Ang Y.-S. Lim B. Robson P. Ng H.-H. Mol. Cell. Biol. 2005; (in press)Google Scholar), and phRLSV40 (normalization control expressing Renilla luciferase) were transfected. Twenty-four hours after transfection, cells were selected for puromycin resistance for 2 further days prior to the luciferase activity being measured. The sequences used for RNAi were: Sox2, 5′-GAAGGAGCACCCGGATTA-3′; Oct4, 5′-GAAGGATGTGGTTCGAGT-3′. Sequence Comparisons Identify Conserved Non-coding Sequences—As Nanog is expressed in both mouse and human pluripotent cells, we reasoned the pluripotent transcription of this gene is maintained through the functional conservation of cis-regulatory elements, and concomitantly, the location and sequence of these elements would be conserved through purifying selection. Therefore we extracted mouse and human Nanog genomic sequences from the public databases. A pair-wise alignment of the mouse and human gene sequences was generated utilizing the Vista on-line tool at LBL Berkley (20Mayor C. Brudno M. Schwartz J.R. Poliakov A. Rubin E.M. Frazer K.A. Pachter L.S. Dubchak I. Bioinformatics. 2000; 16: 1046-1047Crossref PubMed Scopus (798) Google Scholar). We aligned the genomic region from 10 kb upstream of the most 5′ mouse Nanog EST to 10 kb downstream of the most 3′ EST. Peaks of sequence similarity corresponded to the four exons of Nanog, most significantly in the homeodomain-encoding exons 2 and 3 (data not shown). Of the 26.1 kb of non-coding sequence that we compared, the only area of significant sequence conservation was a 200-bp region immediately upstream of the 5′-most EST. This focused our attention on this region for further study as the sequence conservation suggested functionally conserved cis-regulatory elements. Proximal Promoter Is Sufficient to Recapitulate Endogenous Expression—To functionally test this conserved proximal promoter region, we generated stably transfected mouse ESC lines with a plasmid vector containing the mouse sequence from -289 to +117 (relative to the transcription start site) driving the expression of an EGFP. We had defined the Nanog transcription start site as the position of the furthest 5′ public EST; this has since been defined as the predominant transcription start site (4Hart A.H. Hartley L. Ibrahim M. Robb L. Dev. Dyn. 2004; 230: 187-198Crossref PubMed Scopus (277) Google Scholar). After G418 selection for stably transfected ES lines, the majority of colonies fluoresced green, indicating that this region of the Nanog promoter is indeed active in pluripotent cells (Fig. 1B). A number of these NanogEGFP colonies were selected for further analysis. In addition to the pluripotent-positive cis-regulatory elements within this promoter fragment, we were interested in determining whether this promoter contained sufficient cis-regulatory information to down-regulate transcription upon ESC differentiation as occurs with endogenous Nanog. Therefore we compared EGFP expression in the undifferentiated NanogEGFP ESCs to their differentiated derivatives (Fig. 1). Retinoic acid (RA), a strong inducer of ESC differentiation, drastically reduced EGFP expression after 3 days of treatment (Fig. 1, E and F). Culturing NanogEGFP cells in the absence of LIF, a less aggressive differentiation protocol than RA, reduced EGFP expression noticeably after 3 days of culture (Fig. 1, C and D). This expression pattern was seen in three independent NanogEGFP lines. To directly compare transcripts from this NanogEGFP to that of the endogenous Nanog itself, we used real-time PCR (Fig. 1G). The EGFP expression closely paralleled that of the endogenous Nanog as indicated in comparisons of embryoid bodies of 2, 4, 6, and 8 days as well as 2 and 4 days after induction with RA or exclusion of LIF from the medium. In addition, the percentage of EGFP-positive cells, as determined by FACS analysis, in this NanogEGFP reporter line under differing differentiation conditions correlated well with endogenous Nanog expression (Fig. 1G). For instance, the undifferentiated ESCs were 74% EGFP-positive, whereas the 8-day embryoid bodies and 4-day RA-treated cells were 3 and 9% EGFP-positive, respectively. These results indicate that this 406-bp fragment of Nanog contains sufficient cis-regulatory information to recapitulate endogenous Nanog expression, at least as tested in an in vitro ESC-based system. Phylogenetic Footprinting Identifies an Oct-Sox Composite Element—We next aimed to identify the specific cis-regulatory elements responsible for driving pluripotent expression. Generating an alignment of the proximal promoter region from a diverse range of mammals enabled us to identify a strong phylogenetic footprint. A very conservative estimate of the divergence time between the five species used in constructing this alignment (12 million years ago for the mouse-rat split and 60 million years ago between each of the mouse-rat, human, cow, and elephant) provides a cumulative 252 million years of purifying selection to identify a footprint. The greatest stretch of sequence conservation was over a 94-bp region located from position -212 to -119 relative to the Nanog transcription start site; within this, 64 positions were invariant (Fig. 2A). A 16-bp stretch represented the longest uninterrupted invariant sequence and, intriguingly, within this was a 15-bp oct-sox composite element (Fig. 2A) similar to those identified in and known to be functional for pluripotent expression of Fgf4, Utf1, Sox2, Pou5f1, and Fbx15 (8Yuan H. Corbi N. Basilico C. Dailey L. Genes Dev. 1995; 9: 2635-2645Crossref PubMed Scopus (643) Google Scholar, 9Nishimoto M. Fukushima A. Okuda A. Muramatsu M. Mol. Cell. Biol. 1999; 19: 5453-5465Crossref PubMed Scopus (311) Google Scholar, 10Tokuzawa Y. Kaiho E. Maruyama M. Takahashi K. Mitsui K. Maeda M. Niwa H. Yamanaka S. Mol. Cell. Biol. 2003; 23: 2699-2708Crossref PubMed Scopus (221) Google Scholar, 11Tomioka M. Nishimoto M. Miyagi S. Katayanagi T. Fukui N. Niwa H. Muramatsu M. Okuda A. Nucleic Acids Res. 2002; 30: 3202-3213Crossref PubMed Scopus (249) Google Scholar, 12Chew J-L. Loh Y.-H. Zhang W. Chen X. Tam W.-L. Yeap L.-S. Li P. Ang Y.-S. Lim B. Robson P. Ng H.-H. Mol. Cell. Biol. 2005; (in press)Google Scholar). The position of the sox and oct elements relative to each other is the same in all five of these genes, which is indicative of the specific protein-protein contacts between the corresponding transcription factors (Sox2 and Oct4) known to bind this composite element (21Reményi A. Lins K. Nissen L.J. Reinbold R. Schöler H.R. Wilmanns M. Genes Dev. 2003; 17: 2048-2059Crossref PubMed Scopus (301) Google Scholar, 22Williams Jr., D.C. Cai M. Clore G.M. J. Biol. Chem. 2004; 279: 1449-1457Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (137) Google Scholar). Similar to Utf1, Sox2, Pou5f1, and Fbx15, the sox and oct cis-elements in Nanog are immediately adjacent to one another, whereas in Fgf4, 3 bases separate the two elements. Such strong purifying selection at numerous positions within the Nanog promoter suggests a functional role for these positions in the regulation of transcription. Some of these positions, such as the oct-sox composite element, are likely to be important in pluripotent expression, whereas others may represent cis-regulatory elements functional in the post-implantation expression of Nanog. Functional Analysis of the Conserved cis-Regulatory Module—To study the role of specific sequence elements in the activation of pluripotent cell transcription, we constructed a series of luciferase reporter constructs and transfected these into F9 teratocarcinoma cells, a mouse cell line representative of the pluripotent phenotype. The wild-type 406-bp promoter (-289 to +117) from the NanogEGFP construct had significant transcriptional activity in this system; its activity was set arbitrarily to 100% for all further comparisons (Fig. 2B, wt). A shorter region (-230 to +63) still inclusive of the conserved sequence in Fig. 2A had ∼130% activity of the original promoter. This suggests a potential negative regulatory element contained within the -289 to -231 region that is excluded from this shorter promoter but also indicates the presence of pluripotent activator elements within the -230 to +63 span. To test the orientation dependence of the conserved module, we made identical constructs but with a region (spanning -289 to -94) containing this module in either forward or reverse orientation relative to the immediate proximal promoter (-93 to +117). Restriction enzyme sites introduced when creating these two constructs slightly altered the sequence from that of the wild-type control. 79% of wild-type activity was maintained in the forward construct, and 48% was maintained in the reverse construct. These luciferase data are summarized from a total of four different experiments with three wells of cells/construct/experiment. Although significant transcriptional activity was maintained in the reverse orientation, it did consistently show a lower transcriptional activity than the forward (wild-type) orientation, which suggests that the function of this conserved module has subtle orientation effects. The Oct and Sox cis-Elements Are Required for Nanog Promoter Activity—To test their effect on pluripotent transcriptional activity, 3-bp mutations were generated within this core conserved region (Fig. 2A). The M2, M3, and M4 mutations, cumulatively covering seven invariable positions of the 9 bp they span, did not greatly alter transcriptional activity (Fig. 2B). The M3 mutation did not decrease promoter activity, and the M2 and M4 mutations dropped luciferase activity down to ∼65% of wild-type. These subtle effects on promoter activity may indeed be significant in the context of the in vivo pluripotent cell. It is also possible that these positions covered by the M2, M3, and M4 mutations have some other functional role (as they are conserved) other than activation of transcription in pluripotent cells, possibly in the repression of expression in a Nanog-negative cell type or activation of transcription in Nanog-positive cells that occur later in development. As anticipated, mutations affecting the oct and sox elements dropped promoter activity to 17 and 15%, respectively (Fig. 2B); additionally, when both of these sites were mutated in the same construct, activity was reduced to 6% of wild-type. A conserved sequence 20 bp 5′ to the oct-sox composite element also had a very drastic effect on transcription (Fig. 2B, M1), lowering it to 22% of wild type. This suggests that the oct and sox cis-regulatory elements are not the only elements important in pluripotent transcription of Nanog and highlights the utility of phylogenetic footprinting for identifying functionally important cis-regulatory elements. However, our subsequent analysis focused on the sox and oct elements themselves. Sox2 and Oct4 Bind the Composite cis-Element—To determine whether Oct4 and Sox2 were able to recognize the composite element within the Nanog promoter, we performed EMSA using a 37-bp probe (NOS) spanning this sequence combined with nuclear extracts from mouse ESCs. The Fgf4 enhancer element (FOS) known to bind Oct4 and Sox2 in EMSA (see Ref. 8Yuan H. Corbi N. Basilico C. Dailey L. Genes Dev. 1995; 9: 2635-2645Crossref PubMed Scopus (643) Google Scholar) was used as a positive control. Four major protein-DNA complexes (A–D) were observed using the NOS probe (Fig. 3). Similar complexes appeared on the FOS probe with one additional complex (E). The addition of antibodies to either Oct4 or Sox2 resulted in supershifts of complexes A and C or C and E, respectively, indicating that complex A represents binding of the Oct4 monomer; complex E represents the Sox2 monomer, and complex C represents the Oct4/Sox2 heterodimer. Antibody specificity was confirmed as antibodies against JunB or Sox4 had no effect. Significantly, Sox2 in E14 extracts was not observed binding as a monomer to NOS. Following transient transfection of Sox2 into NIH 3T3 cells, we observed that Sox2 did bind NOS as a monomer in EMSA (not shown), indicating that Sox2 is capable of binding the Nanog element in the absence of Oct4. This suggests that all available Sox2 in the E14 extracts binds as a heterodimer with the more abundant Oct4 and that heterodimer formation is favored on the Nanog element relative to the Fgf4 element. This is corroborated by the observation that the ratio of the intensity of the heterodimer complex (C) to that of the Oct4 monomer complex (A) was consistently greater on NOS as compared with FOS (Fig. 3). We also observed a consistently faster mobility of the Oct4/Sox2 heterodimer binding NOS as compared with that binding FOS. This is compatible with the idea that a more closed conformation could occur on the NOS sequence due to the lack of nucleotides separating the oct and sox elements, as occurs in the FOS sequence.

Set1, the yeast histone H3-lysine 4 (H3-K4) methylase, is recruited by the Pol II elongation machinery to a highly localized domain at the 5′ portion of active mRNA coding regions. Set1 association depends upon the TFIIH-associated kinase that phosphorylates the Pol II C-terminal domain (CTD) and mediates the transition between initiation and elongation, and Set1 interacts with the form of Pol II whose CTD is phosphorylated at serine 5 but not serine 2. The Rtf1 and Paf1 components of the Pol II-associated Paf1 complex are also important for Set1 recruitment. Although the level of dimethylated H3-K4 is fairly uniform throughout the genome, the pattern of trimethylated H3-K4 strongly correlates with Set1 occupancy. Hypermethylated H3-K4 within the mRNA coding region persists for considerable time after transcriptional inactivation and Set1 dissociation from the chromatin, indicating that H3-K4 hypermethylation provides a molecular memory of recent transcriptional activity. Set1, the yeast histone H3-lysine 4 (H3-K4) methylase, is recruited by the Pol II elongation machinery to a highly localized domain at the 5′ portion of active mRNA coding regions. Set1 association depends upon the TFIIH-associated kinase that phosphorylates the Pol II C-terminal domain (CTD) and mediates the transition between initiation and elongation, and Set1 interacts with the form of Pol II whose CTD is phosphorylated at serine 5 but not serine 2. The Rtf1 and Paf1 components of the Pol II-associated Paf1 complex are also important for Set1 recruitment. Although the level of dimethylated H3-K4 is fairly uniform throughout the genome, the pattern of trimethylated H3-K4 strongly correlates with Set1 occupancy. Hypermethylated H3-K4 within the mRNA coding region persists for considerable time after transcriptional inactivation and Set1 dissociation from the chromatin, indicating that H3-K4 hypermethylation provides a molecular memory of recent transcriptional activity.

Using high-density oligonucleotide arrays representing essentially all nonrepetitive sequences on human chromosomes 21 and 22, we map the binding sites in vivo for three DNA binding transcription factors, Sp1, cMyc, and p53, in an unbiased manner. This mapping reveals an unexpectedly large number of transcription factor binding site (TFBS) regions, with a minimal estimate of 12,000 for Sp1, 25,000 for cMyc, and 1600 for p53 when extrapolated to the full genome. Only 22% of these TFBS regions are located at the 5′ termini of protein-coding genes while 36% lie within or immediately 3′ to well-characterized genes and are significantly correlated with noncoding RNAs. A significant number of these noncoding RNAs are regulated in response to retinoic acid, and overlapping pairs of protein-coding and noncoding RNAs are often coregulated. Thus, the human genome contains roughly comparable numbers of protein-coding and noncoding genes that are bound by common transcription factors and regulated by common environmental signals.

Yi Zhang, Huck-Hui Ng, Hediye Erdjument-Bromage, Paul Tempst, Adrian Bird, and Danny Reinberg Howard Hughes Medical Institute (HHMI), Division of Nucleic Acids Enzymology, Department of Biochemistry, University of Medicine and Dentistry of New Jersey, Robert Wood Johnson Medical School, Piscataway, New Jersey 08854 USA; Institute of Cell and Molecular Biology, University of Edinburgh, Edinburgh EH9 3JR, UK; Molecular Biology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, New York 10021 USA

Mammalian DNA is methylated at many CpG dinucleotides. The biological consequences of methylation are mediated by a family of methyl-CpG binding proteins1,2,3,4. The best characterized family member is MeCP2, a transcriptional repressor that recruits histone deacetylases5,6,7. Our report concerns MBD2, which can bind methylated DNA in vivo and in vitro 4 and has been reported to actively demethylate DNA (ref. 8). As DNA methylation causes gene silencing, the MBD2 demethylase is a candidate transcriptional activator. Using specific antibodies, however, we find here that MBD2 in HeLa cells is associated with histone deacetylase (HDAC) in the MeCP1 repressor complex1,9. An affinity-purified HDAC1 corepressor complex10,11 also contains MBD2, suggesting that MeCP1 corresponds to a fraction of this complex. Exogenous MBD2 represses transcription in a transient assay, and repression can be relieved by the deacetylase inhibitor trichostatin A (TSA; ref. 12). In our hands, MBD2 does not demethylate DNA. Our data suggest that HeLa cells, which lack the known methylation-dependent repressor MeCP2, use an alternative pathway involving MBD2 to silence methylated genes.

The N-terminal tails of core histones are subjected to multiple covalent modifications, including acetylation, methylation, and phosphorylation. Similar to acetylation, histone methylation has emerged as an important player in regulating chromatin dynamics and gene activity. Histone methylation occurs on arginine and lysine residues and is catalyzed by two families of proteins, the protein arginine methyltransferase family and the SET-domain-containing methyltransferase family. Here, we report that lysine 79 (K79) of H3, located in the globular domain, can be methylated. K79 methylation occurs in a variety of organisms ranging from yeast to human. In budding yeast, K79 methylation is mediated by the silencing protein DOT1. Consistent with conservation of K79 methylation, DOT1 homologs can be found in a variety of eukaryotic organisms. We identified a human DOT1-like (DOT1L) protein and demonstrated that this protein possesses intrinsic H3-K79-specific histone methyltransferase (HMTase) activity in vitro and in vivo. Furthermore, we found that K79 methylation level is regulated throughout the cell cycle. Thus, our studies reveal a new methylation site and define a novel family of histone lysine methyltransferase.