Protein interactions form a network whose structure drives cellular function and whose organization informs biological inquiry. Using high-throughput affinity-purification mass spectrometry, we identify interacting partners for 2,594 human proteins in HEK293T cells. The resulting network (BioPlex) contains 23,744 interactions among 7,668 proteins with 86% previously undocumented. BioPlex accurately depicts known complexes, attaining 80%–100% coverage for most CORUM complexes. The network readily subdivides into communities that correspond to complexes or clusters of functionally related proteins. More generally, network architecture reflects cellular localization, biological process, and molecular function, enabling functional characterization of thousands of proteins. Network structure also reveals associations among thousands of protein domains, suggesting a basis for examining structurally related proteins. Finally, BioPlex, in combination with other approaches, can be used to reveal interactions of biological or clinical significance. For example, mutations in the membrane protein VAPB implicated in familial amyotrophic lateral sclerosis perturb a defined community of interactors.

Affinity purification–mass spectrometry elucidates protein interaction networks and co-complexes to build, to our knowledge, the largest experimentally derived human protein interaction network so far, termed BioPlex 2.0. The thousands of proteins within a cell function as modules and networks to coordinate their biological activities. Large-scale efforts are underway to build protein interaction maps that reveal cellular proteome architecture. Here, Wade Harper and colleagues use affinity purification mass spectrometry to elucidate protein interaction networks and co-complexes and build the largest experimentally derived human proteome interaction network to date, termed BioPlex 2.0. Containing over 29,000 novel co-associations and 1,300 protein communities representing diverse cellular activities, BioPlex 2.0 is more than double the size of their earlier interaction network BioPlex 1.0 and will be a valuable resource for exploring uncharacterized proteins and candidate disease-linked genes. The physiology of a cell can be viewed as the product of thousands of proteins acting in concert to shape the cellular response. Coordination is achieved in part through networks of protein–protein interactions that assemble functionally related proteins into complexes, organelles, and signal transduction pathways. Understanding the architecture of the human proteome has the potential to inform cellular, structural, and evolutionary mechanisms and is critical to elucidating how genome variation contributes to disease1,2,3. Here we present BioPlex 2.0 (Biophysical Interactions of ORFeome-derived complexes), which uses robust affinity purification–mass spectrometry methodology4 to elucidate protein interaction networks and co-complexes nucleated by more than 25% of protein-coding genes from the human genome, and constitutes, to our knowledge, the largest such network so far. With more than 56,000 candidate interactions, BioPlex 2.0 contains more than 29,000 previously unknown co-associations and provides functional insights into hundreds of poorly characterized proteins while enhancing network-based analyses of domain associations, subcellular localization, and co-complex formation. Unsupervised Markov clustering5 of interacting proteins identified more than 1,300 protein communities representing diverse cellular activities. Genes essential for cell fitness6,7 are enriched within 53 communities representing central cellular functions. Moreover, we identified 442 communities associated with more than 2,000 disease annotations, placing numerous candidate disease genes into a cellular framework. BioPlex 2.0 exceeds previous experimentally derived interaction networks in depth and breadth, and will be a valuable resource for exploring the biology of incompletely characterized proteins and for elucidating larger-scale patterns of proteome organization.

Damaged mitochondria are detrimental to cellular homeostasis. One mechanism for removal of damaged mitochondria involves the PINK1-PARKIN pathway, which poly-ubiquitylates damaged mitochondria to promote mitophagy. We report that assembly of ubiquitin chains on mitochondria triggers autophagy adaptor recruitment concomitantly with activation of the TBK1 kinase, which physically associates with OPTN, NDP52, and SQSTM1. TBK1 activation in HeLa cells requires OPTN and NDP52 and OPTN ubiquitin chain binding. In addition to the known role of S177 phosphorylation in OPTN on ATG8 recruitment, TBK1-dependent phosphorylation on S473 and S513 promotes ubiquitin chain binding in vitro as well as TBK1 activation, OPTN mitochondrial retention, and efficient mitophagy in vivo. These data reveal a self-reinforcing positive feedback mechanism that coordinates TBK1-dependent autophagy adaptor phosphorylation with the assembly of ubiquitin chains on mitochondria to facilitate efficient mitophagy, and mechanistically links genes mutated in Parkinson’s disease and amyotrophic lateral sclerosis in a common selective autophagy pathway.

Summary

 Thousands of interactions assemble proteins into modules that impart spatial and functional organization to the cellular proteome. Through affinity-purification mass spectrometry, we have created two proteome-scale, cell-line-specific interaction networks. The first, BioPlex 3.0, results from affinity purification of 10,128 human proteins—half the proteome—in 293T cells and includes 118,162 interactions among 14,586 proteins. The second results from 5,522 immunoprecipitations in HCT116 cells. These networks model the interactome whose structure encodes protein function, localization, and complex membership. Comparison across cell lines validates thousands of interactions and reveals extensive customization. Whereas shared interactions reside in core complexes and involve essential proteins, cell-specific interactions link these complexes, "rewiring" subnetworks within each cell's interactome. Interactions covary among proteins of shared function as the proteome remodels to produce each cell's phenotype. Viewable interactively online through BioPlexExplorer, these networks define principles of proteome organization and enable unknown protein characterization.

Exercise provides many health benefits, including improved metabolism, cardiovascular health, and cognition. We have shown previously that FNDC5, a type I transmembrane protein, and its circulating form, irisin, convey some of these benefits in mice. However, recent reports questioned the existence of circulating human irisin both because human FNDC5 has a non-canonical ATA translation start and because of claims that many human irisin antibodies used in commercial ELISA kits lack required specificity. In this paper we have identified and quantitated human irisin in plasma using mass spectrometry with control peptides enriched with heavy stable isotopes as internal standards. This precise state-of-the-art method shows that human irisin is mainly translated from its non-canonical start codon and circulates at ∼3.6 ng/ml in sedentary individuals; this level is increased to ∼4.3 ng/ml in individuals undergoing aerobic interval training. These data unequivocally demonstrate that human irisin exists, circulates, and is regulated by exercise.

Cell size varies greatly between cell types, yet within a specific cell type and growth condition, cell size is narrowly distributed. Why maintenance of a cell-type specific cell size is important remains poorly understood. Here we show that growing budding yeast and primary mammalian cells beyond a certain size impairs gene induction, cell-cycle progression, and cell signaling. These defects are due to the inability of large cells to scale nucleic acid and protein biosynthesis in accordance with cell volume increase, which effectively leads to cytoplasm dilution. We further show that loss of scaling beyond a certain critical size is due to DNA becoming limiting. Based on the observation that senescent cells are large and exhibit many of the phenotypes of large cells, we propose that the range of DNA:cytoplasm ratio that supports optimal cell function is limited and that ratios outside these bounds contribute to aging.

Isobaric labeling empowers proteome-wide expression measurements simultaneously across multiple samples. Here an expanded set of 16 isobaric reagents based on an isobutyl-proline immonium ion reporter structure (TMTpro) is presented. These reagents have similar characteristics to existing tandem mass tag reagents but with increased fragmentation efficiency and signal. In a proteome-scale example dataset, we compared eight common cell lines with and without Torin1 treatment with three replicates, quantifying more than 8,800 proteins (mean of 7.5 peptides per protein) per replicate with an analysis time of only 1.1 h per proteome. Finally, we modified the thermal stability assay to examine proteome-wide melting shifts after treatment with DMSO, 1 or 20 µM staurosporine with five replicates. This assay identified and dose-stratified staurosporine binding to 228 cellular kinases in just one, 18-h experiment. TMTpro reagents allow complex experimental designs—all with essentially no missing values across the 16 samples and no loss in quantitative integrity. A set of isobaric labeling reagents called TMTpro enables deep quantitative comparisons of proteome measurements across 16 samples.

Mass spectrometry (MS) coupled toisobaric labeling has developed rapidly into a powerful strategy for high-throughput protein quantification. Sample multiplexing and exceptional sensitivity allow for the quantification of tens of thousands of peptides and, by inference, thousands of proteins from multiple samples in a single MS experiment. Accurate quantification demands a consistent and robust sample-preparation strategy. Here, we present a detailed workflow for SPS-MS3-based quantitative abundance profiling of tandem mass tag (TMT)-labeled proteins and phosphopeptides that we have named the streamlined (SL)-TMT protocol. We describe a universally applicable strategy that requires minimal individual sample processing and permits the seamless addition of a phosphopeptide enrichment step ("mini-phos") with little deviation from the deep proteome analysis. To showcase our workflow, we profile the proteome of wild-type Saccharomyces cerevisiae yeast grown with either glucose or pyruvate as the carbon source. Here, we have established a streamlined TMT protocol that enables deep proteome and medium-scale phosphoproteome analysis.

Significance PINK1 protein kinase and PARKIN UB ligase are mutated in inherited forms of Parkinson’s disease and several cancers. Thus, it is of great significance to understand normal functions that could be disrupted in disease. A role for PARKIN and PINK1 is in mediating autophagy of damaged mitochondria (mitophagy) through polyubiquitylation of numerous mitochondrial outer membrane proteins in a reaction that involves phosphorylation of both PARKIN and ubiquitin (UB) by PINK1. The mechanism remains unclear, however, due to challenges in defining individual steps in the pathway. Here, we use a UB replacement system to elucidate steps in the pathway that require PARKIN and/or UB phosphorylation by PINK1 and provide evidence of a PINK1- and UB-driven feed-forward mechanism important for efficient mitochondrial ubiquitylation and mitophagy.