Affinity purification–mass spectrometry elucidates protein interaction networks and co-complexes to build, to our knowledge, the largest experimentally derived human protein interaction network so far, termed BioPlex 2.0. The thousands of proteins within a cell function as modules and networks to coordinate their biological activities. Large-scale efforts are underway to build protein interaction maps that reveal cellular proteome architecture. Here, Wade Harper and colleagues use affinity purification mass spectrometry to elucidate protein interaction networks and co-complexes and build the largest experimentally derived human proteome interaction network to date, termed BioPlex 2.0. Containing over 29,000 novel co-associations and 1,300 protein communities representing diverse cellular activities, BioPlex 2.0 is more than double the size of their earlier interaction network BioPlex 1.0 and will be a valuable resource for exploring uncharacterized proteins and candidate disease-linked genes. The physiology of a cell can be viewed as the product of thousands of proteins acting in concert to shape the cellular response. Coordination is achieved in part through networks of protein–protein interactions that assemble functionally related proteins into complexes, organelles, and signal transduction pathways. Understanding the architecture of the human proteome has the potential to inform cellular, structural, and evolutionary mechanisms and is critical to elucidating how genome variation contributes to disease1,2,3. Here we present BioPlex 2.0 (Biophysical Interactions of ORFeome-derived complexes), which uses robust affinity purification–mass spectrometry methodology4 to elucidate protein interaction networks and co-complexes nucleated by more than 25% of protein-coding genes from the human genome, and constitutes, to our knowledge, the largest such network so far. With more than 56,000 candidate interactions, BioPlex 2.0 contains more than 29,000 previously unknown co-associations and provides functional insights into hundreds of poorly characterized proteins while enhancing network-based analyses of domain associations, subcellular localization, and co-complex formation. Unsupervised Markov clustering5 of interacting proteins identified more than 1,300 protein communities representing diverse cellular activities. Genes essential for cell fitness6,7 are enriched within 53 communities representing central cellular functions. Moreover, we identified 442 communities associated with more than 2,000 disease annotations, placing numerous candidate disease genes into a cellular framework. BioPlex 2.0 exceeds previous experimentally derived interaction networks in depth and breadth, and will be a valuable resource for exploring the biology of incompletely characterized proteins and for elucidating larger-scale patterns of proteome organization.

Summary

 Proteins are essential agents of biological processes. To date, large-scale profiling of cell line collections including the Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) has focused primarily on genetic information whereas deep interrogation of the proteome has remained out of reach. Here, we expand the CCLE through quantitative profiling of thousands of proteins by mass spectrometry across 375 cell lines from diverse lineages to reveal information undiscovered by DNA and RNA methods. We observe unexpected correlations within and between pathways that are largely absent from RNA. An analysis of microsatellite instable (MSI) cell lines reveals the dysregulation of specific protein complexes associated with surveillance of mutation and translation. These and other protein complexes were associated with sensitivity to knockdown of several different genes. These data in conjunction with the wider CCLE are a broad resource to explore cellular behavior and facilitate cancer research.

Summary

 Thousands of interactions assemble proteins into modules that impart spatial and functional organization to the cellular proteome. Through affinity-purification mass spectrometry, we have created two proteome-scale, cell-line-specific interaction networks. The first, BioPlex 3.0, results from affinity purification of 10,128 human proteins—half the proteome—in 293T cells and includes 118,162 interactions among 14,586 proteins. The second results from 5,522 immunoprecipitations in HCT116 cells. These networks model the interactome whose structure encodes protein function, localization, and complex membership. Comparison across cell lines validates thousands of interactions and reveals extensive customization. Whereas shared interactions reside in core complexes and involve essential proteins, cell-specific interactions link these complexes, "rewiring" subnetworks within each cell's interactome. Interactions covary among proteins of shared function as the proteome remodels to produce each cell's phenotype. Viewable interactively online through BioPlexExplorer, these networks define principles of proteome organization and enable unknown protein characterization.

Mitosis is a process involving a complex series of events that require careful coordination. Protein phosphorylation by a small number of kinases, in particular Aurora A, Aurora B, the cyclin-dependent kinase-cyclin complex Cdk1/cyclinB, and Polo-like kinase 1 (Plk1), orchestrates almost every step of cell division, from entry into mitosis to cytokinesis. To discover more about the functions of Aurora A, Aurora B, and kinases of the Plk family, we mapped mitotic phosphorylation sites to these kinases through the combined use of quantitative phosphoproteomics and selective targeting of kinase activities by small-molecule inhibitors. Using this integrated approach, we connected 778 phosphorylation sites on 562 proteins with these enzymes in cells arrested in mitosis. By connecting the kinases to protein complexes, we associated these kinases with functional modules. In addition to predicting previously unknown functions, this work establishes additional substrate-recognition motifs for these kinases and provides an analytical template for further use in dissecting kinase signaling events in other areas of cellular signaling and systems biology.

Isobaric labeling empowers proteome-wide expression measurements simultaneously across multiple samples. Here an expanded set of 16 isobaric reagents based on an isobutyl-proline immonium ion reporter structure (TMTpro) is presented. These reagents have similar characteristics to existing tandem mass tag reagents but with increased fragmentation efficiency and signal. In a proteome-scale example dataset, we compared eight common cell lines with and without Torin1 treatment with three replicates, quantifying more than 8,800 proteins (mean of 7.5 peptides per protein) per replicate with an analysis time of only 1.1 h per proteome. Finally, we modified the thermal stability assay to examine proteome-wide melting shifts after treatment with DMSO, 1 or 20 µM staurosporine with five replicates. This assay identified and dose-stratified staurosporine binding to 228 cellular kinases in just one, 18-h experiment. TMTpro reagents allow complex experimental designs—all with essentially no missing values across the 16 samples and no loss in quantitative integrity. A set of isobaric labeling reagents called TMTpro enables deep quantitative comparisons of proteome measurements across 16 samples.

Multiplexed quantitative analyses of complex proteomes enable deep biological insight. While a multitude of workflows have been developed for multiplexed analyses, the most quantitatively accurate method (SPS-MS3) suffers from long acquisition duty cycles. We built a new, real-time database search (RTS) platform, Orbiter, to combat the SPS-MS3 method's longer duty cycles. RTS with Orbiter eliminates SPS-MS3 scans if no peptide matches to a given spectrum. With Orbiter's online proteomic analytical pipeline, which includes RTS and false discovery rate analysis, it was possible to process a single spectrum database search in less than 10 ms. The result is a fast, functional means to identify peptide spectral matches using Comet, filter these matches, and more efficiently quantify proteins of interest. Importantly, the use of Comet for peptide spectral matching allowed for a fully featured search, including analysis of post-translational modifications, with well-known and extensively validated scoring. These data could then be used to trigger subsequent scans in an adaptive and flexible manner. In this work we tested the utility of this adaptive data acquisition platform to improve the efficiency and accuracy of multiplexed quantitative experiments. We found that RTS enabled a 2-fold increase in mass spectrometric data acquisition efficiency. Orbiter's RTS quantified more than 8000 proteins across 10 proteomes in half the time of an SPS-MS3 analysis (18 h for RTS, 36 h for SPS-MS3).

Multiplexed, isobaric tagging methods are powerful techniques to increase throughput, precision, and accuracy in quantitative proteomics. The dynamic range and accuracy of quantitation, however, can be limited by coisolation of tag-containing peptides that release reporter ions and conflate quantitative measurements across precursors. Methods to alleviate these effects often lead to the loss of protein and peptide identifications through online or offline filtering of interference containing spectra. To alleviate this effect, high-Field Asymmetric-waveform Ion Mobility Spectroscopy (FAIMS) has been proposed as a method to reduce precursor coisolation and improve the accuracy and dynamic range of multiplex quantitation. Here we tested the use of FAIMS to improve quantitative accuracy using previously established TMT-based interference standards (triple-knockout [TKO] and Human-Yeast Proteomics Resource [HYPER]). We observed that FAIMS robustly improved the quantitative accuracy of both high-resolution MS2 (HRMS2) and synchronous precursor selection MS3 (SPS-MS3)-based methods without sacrificing protein identifications. We further optimized and characterized the main factors that enable robust use of FAIMS for multiplexed quantitation. We highlight these factors and provide method recommendations to take advantage of FAIMS technology to improve isobaric-tag-quantification moving forward.

Many growth factors and cytokines signal by binding to the extracellular domains of their receptors and driving association and transphosphorylation of the receptor intracellular tyrosine kinase domains, initiating downstream signaling cascades. To enable systematic exploration of how receptor valency and geometry affect signaling outcomes, we designed cyclic homo-oligomers with up to 8 subunits using repeat protein building blocks that can be modularly extended. By incorporating a de novo-designed fibroblast growth factor receptor (FGFR)-binding module into these scaffolds, we generated a series of synthetic signaling ligands that exhibit potent valency- and geometry-dependent Ca2+ release and mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway activation. The high specificity of the designed agonists reveals distinct roles for two FGFR splice variants in driving arterial endothelium and perivascular cell fates during early vascular development. Our designed modular assemblies should be broadly useful for unraveling the complexities of signaling in key developmental transitions and for developing future therapeutic applications.