Abstract Since the first human case was reported in Wuhan Province, China in December 2019, SARS-CoV-2 has caused millions of human infections in more than 200 countries worldwide with an approximately 4.01% case-fatality rate (as of 27 July, 2020; based on a WHO situation report), and COVID-19 pandemic has paralyzed our global community. Even though a few candidate drugs, such as remdesivir (a broad antiviral prodrug) and hydroxychloroquine, have been investigated in human clinical trials, their therapeutic efficacy needs to be clarified further to be used to treat COVID-19 patients. Here we show that pyronaridine and artesunate, which are the chemical components of anti-malarial drug Pyramax ® , exhibit antiviral activity against SARS-CoV-2 and influenza viruses. In human lung epithelial (Calu-3) cells, pyronaridine and artesunate were highly effective against SARS-CoV-2 while hydroxychloroquine did not show any effect at concentrations of less than 100 μM. In viral growth kinetics, both pyronaridine and artesunate inhibited the growth of SARS-CoV-2 and seasonal influenza A virus in Calu-3 cells. Taken together, we suggest that artesunate and pyronaridine might be effective drug candidates for use in human patients with COVID-19 and/or influenza, which may co-circulate during this coming winter season.

Abstract Observational studies of the ongoing coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak suggest that a cytokine storm is involved in the pathogenesis of severe illness. However, the molecular mechanisms underlying the altered pathological inflammation in COVID-19 are largely unknown. We report here that toll-like receptor (TLR) 4-mediated inflammatory signaling molecules are upregulated in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from COVID-19 patients, compared with healthy controls. Among the most highly increased inflammatory mediators in severe/critically ill patients, S100A9, an alarmin and TLR4 ligand, was found as a noteworthy biomarker, because it inversely correlated with the serum albumin levels. These data support a link between TLR4 signaling and pathological inflammation during COVID-19 and contribute to develop therapeutic approaches through targeting TLR4-mediated inflammation.

ABSTRACT As the SARS-CoV-2 pandemic remains uncontrolled owing to the continuous emergence of variants of concern, there is an immediate need to implement the most effective antiviral treatment strategies, especially for risk groups. Here, we evaluated the therapeutic potency of nirmatrelvir, remdesivir, and molnupiravir and their combinations in SARS-CoV-2-infected K18-hACE2 transgenic mice. Systemic treatment of mice with each drug (20 mg/kg) resulted in slightly enhanced antiviral efficacy and yielded an increased life expectancy of only about 20–40% survival. However, combination therapy with nirmatrelvir (20 mg/kg) and molnupiravir (20 mg/kg) in lethally infected mice showed profound inhibition of SARS-CoV-2 replication in both the lung and brain and synergistically improved survival times up to 80% compared to those with nirmatrelvir (P= 0.0001) and molnupiravir (P= 0.0001) administered alone. This combination therapy effectively reduced clinical severity score, virus-induced tissue damage, and viral distribution compared to those in animals treated with these monotherapies. Furthermore, all these assessments associated with this combination were also significantly higher than that of mice receiving remdesivir monotherapy (P= 0.0001) and the nirmatrelvir (20 mg/kg) and remdesivir (20 mg/kg) combination (P= 0.0001), underscored the clinical significance of this combination. By contrast, the nirmatrelvir and remdesivir combination showed less antiviral efficacy, with lower survival compared to nirmatrelvir monotherapy, demonstrating the inefficient therapeutic effect of this combination. The combination therapy with nirmatrelvir and molnupiravir contributes to alleviated morbidity and mortality, which can serve as a basis for the design of clinical studies of this combination in the treatment of COVID-19 patients. IMPORTANCE Since SARS-CoV-2 spread rapidly with the emergence of new variants of concerns, it is necessary to develop effective treatment strategies to treat elderly individuals and those with comorbidities. Antiviral therapy using a combination of drugs is more effective in eradicating viruses and will undoubtedly improve the clinical outcome and survival probability of hospitalized SARS-CoV-2 patients. In the current study, we observed three FDA-approved antivirals nirmatrelvir, remdesivir, and molnupiravir have therapeutic significance with moderate survival for their monotherapies against SARS-CoV-2 infected K18-hACE2 mouse model. The combination of nirmatrelvir and molnupiravir showed significant antiviral activity and a higher survival rate of approximately 80%, providing in vivo evidence of the potential utility of this combination. In contrast, nirmatrelvir and remdesivir combination showed less antiviral potency and emphasized the ineffective significance with less survival. The current study suggests that the nirmatrelvir and molnupiravir combination is an effective drug regimen strategy in treating SARS-CoV-2 patients.

Abstract The Delta variant originally from India is rapidly spreading across the world and causes to resurge infections of SARS-CoV-2. We previously reported that CT-P59 presented its in vivo potency against Beta and Gamma variants, despite its reduced activity in cell experiments. Yet, it remains uncertain to exert the antiviral effect of CT-P59 on the Delta and its associated variants (L452R). To tackle this question, we carried out cell tests and animal study. CT-P59 showed reduced antiviral activity but enabled neutralization against Delta, Epsilon, and Kappa variants in cells. In line with in vitro results, the mouse challenge experiment with the Delta variant substantiated in vivo potency of CT-P59 showing symptom remission and virus abrogation in the respiratory tract. Collectively, cell and animal studies showed that CT-P59 is effective against the Delta variant infection, hinting that CT-P59 has therapeutic potency for patients infected with Delta and its associated variants. Highlights CT-P59 exerts the antiviral effect on authentic Delta, Epsilon and Kappa variants in cell-based experiments. CT-P59 showed neutralizing potency against variants including Delta, Epsilon, Kappa, L452R, T478K and P681H pseudovirus variants. The administration of clinically relevant dose of CT-P59 showed in vivo protection against Delta variants in animal challenge experiment.

Abstract With the emergence of multiple highly transmissible SARS-CoV-2 variants during the recent pandemic, the comparison of their infectivity has become a substantially critical issue for public health. However, a direct assessment of these viral characteristics has been challenging due to the lack of appropriate experimental models and efficient methods. Here, we integrated human alveolar organoids and single-cell transcriptome sequencing techniques to facilitate the evaluation. In a proof-of-concept study using the assay with four highly transmissible SARS-CoV-2 variants, including GR (B.1.1.119), Alpha (B.1.1.7), Delta (B.1.617.2), and Omicron (BA.1), a rapid evaluation of the relative infectivity was possible. Our results demonstrate that the Omicron (BA.1) variant is 3-5-fold more infectious to human alveolar cells than the other SARS-CoV-2 variants at the early phase of infection. To our knowledge, this study provides the first direct measurement of the infectivity of the Omicron variant and new experimental procedures that can be applied for monitoring newly emerging viral variants.

Abstract Mycobacterium abscessus (Mab) is a rapidly growing multidrug-resistant species among nontuberculous mycobacteria (NTM). Pulmonary infections caused by M. abscessus are difficult to treat and often result in an accelerated condition and premature death of immunosuppressed patients such as those with cystic fibrosis, putting them at a greater risk of other infections and increasing the urgency of developing a novel class of antibiotics. Here, we explore the use of toxin and antitoxin (TA) as an interesting and promising new class of target in a fragment-based drug-discovery approach. A de novo structure of Mab3862, an antitoxin of type 2 TA class in M. abscessus was elucidated and followed by drug discovery work. Very small molecules (fragments) are used to bind the antitoxin and then elaborated into drug-sized molecule that potentially trigger conformational change to prevent formation of toxin-antitoxin complex. Biophysical screening methods and binding-mode guidance from in silico docking were conducted. Grouping of fragments based on the binding site, creating a pharmacophore model, can facilitate further studies for rational design of inhibitors. Although targeting the TA complex for developing antibiotics is relatively novel and challenging, this could possibly open the gate for exploring it as potential drug target. Targeting one of the TA pairs might not be completely bactericidal. However, using this approach strategically with other antibiotics for synergic effect might be effective for patients with a persistence phenotype requiring prolonged therapy.

Abstract Structures of the human lysosomal K + channel TMEM175 in open and closed states revealed a novel architecture lacking the canonical K + selectivity filter motif present in previously known K + channel structures. A hydrophobic constriction composed of four isoleucine residues was resolved in the pore and proposed to serve as the gate in the closed state, and to confer ion selectivity in the open state. Here, we achieve higher-resolution structures of the open and closed states and employ molecular dynamics simulations to analyze the conducting properties of the putative open state, demonstrating that it is capable of permeating K + ions at the expected rate. Monovalent cations must dehydrate significantly to penetrate the narrow hydrophobic constriction, but ion flow is assisted by a favorable electrostatic field generated by the protein that spans the length of the pore. The balance of these opposing energetic factors explains why permeation is feasible, and why TMEM175 is selective for K + over Na + , despite the absence of the canonical selectivity filter. Accordingly, mutagenesis experiments reveal an exquisite sensitivity of the channel to perturbations that mitigate the constriction. Together, these data reveal a novel mechanism for selective permeation of ions by TMEM175 that is unlike that of other K + channels.

Abstract The ongoing emergence of SARS-CoV-2 Omicron subvariants and their rapid worldwide spread pose a threat to public health. From November 2022 to February 2023, newly emerged Omicron subvariants, including BQ.1.1, BF.7, BA.5.2, XBB.1, XBB.1.5, and BN.1.9, became prevalent global strains (>5% global prevalence). These Omicron subvariants are resistant to several therapeutic antibodies. Thus, the antiviral activities of current drugs such as remdesivir, molnupiravir, and nirmatrelvir, which target highly conserved regions of SARS-CoV-2, against newly emerged Omicron subvariants need to be evaluated. We assessed the antiviral efficacy of the drugs using half maximal inhibitory concentration (IC 50 ) against human isolated 23 Omicron subvariants and four former SARS-CoV-2 variants of concern (VOC) and compared them with the antiviral efficacy of these drugs against the SARS-CoV-2 reference strain (hCoV/Korea/KCDC03/2020). Maximal IC 50 fold changes of remdesivir, molnupiravir, and nirmatrelvir were 1.9- (BA.2.75.2), 1.2-(B.1.627.2), and 1.4-fold (BA.2.3), respectively, compared to median IC 50 values of the reference strain. Moreover, median IC 50 -fold changes of remdesivir, molnupiravir, and nirmatrelvir against the Omicron variants were 0.96, 0.4, and 0.62, similar to 1.02, 0.88, and 0.67, respectively, of median IC 50 -fold changes for previous VOC. Although K90R and P132H in Nsp 5, and P323L, A529V, G671S, V405F, and ins823D in Nsp 12 mutations were identified, these amino acid substitutions did not affect drug antiviral activity. Altogether, these results indicated that the current antivirals retain antiviral efficacy against newly emerged Omicron subvariants, and provide comprehensive information on the antiviral efficacy of these drugs.

Studies have shown that the current human reference genome (GRCh38) might miss information for some populations, but 'exactly what we miss' is still elusive due to the lower contiguity of non-reference genomes. We juxtaposed the GRCh38 with high contiguity genome assemblies, AK1, to show that ~1.8% (~53.4 Mbp) of AK1 sequences missed in GRCh38 with ~0.76% (~22.2 Mbp) of ectopic chromosomes. The unique AK1 sequences harbored ~1,390 putative coding elements. We found that ~5.3Mb (~0.2%) of the AK1 sequences aligned and recovered the 'unmapped' reads of fourteen individuals (5 East-Asians, 4 Europeans, and 5 Africans) as a reference. The regions that 'unmapped' reads aligned included 110 common (shared between ≥2 individuals) and 38 globally (≥7 individuals) missing regions with 25 candidate coding elements. We verified that many of the common missing regions exist in multiple populations and chimpanzee's DNA. Our study illuminates not only the discovery of missing information but the use of highly precise ethnic genomes in understanding human genetics.

SARS-CoV-2 is a betacoronavirus that is responsible for the COVID-19 pandemic. The genome of SARS-CoV-2 was reported recently, but its transcriptomic architecture is unknown. Utilizing two complementary sequencing techniques, we here present a high-resolution map of the SARS-CoV-2 transcriptome and epitranscriptome. DNA nanoball sequencing shows that the transcriptome is highly complex owing to numerous recombination events, both canonical and noncanonical. In addition to the genomic RNA and subgenomic RNAs common in all coronaviruses, SARS-CoV-2 produces a large number of transcripts encoding unknown ORFs with fusion, deletion, and/or frameshift. Using nanopore direct RNA sequencing, we further find at least 41 RNA modification sites on viral transcripts, with the most frequent motif being AAGAA. Modified RNAs have shorter poly(A) tails than unmodified RNAs, suggesting a link between the internal modification and the 3′ tail. Functional investigation of the unknown ORFs and RNA modifications discovered in this study will open new directions to our understanding of the life cycle and pathogenicity of SARS-CoV-2.Highlights