Abstract The clinical success of CRISPR therapies hinges on the safety and efficacy of Cas proteins. The Cas9 from Francisella novicida (FnCas9) is highly precise, with a negligible affinity for mismatched substrates, but its low cellular targeting efficiency limits therapeutic use. Here, we rationally engineer the protein to develop enhanced FnCas9 (enFnCas9) variants and broaden their accessibility across human genomic sites by ~3.5-fold. The enFnCas9 proteins with single mismatch specificity expanded the target range of FnCas9-based CRISPR diagnostics to detect the pathogenic DNA signatures. They outperform Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) and its engineered derivatives in on-target editing efficiency, knock-in rates, and off-target specificity. enFnCas9 can be combined with extended gRNAs for robust base editing at sites which are inaccessible to PAM-constrained canonical base editors. Finally, we demonstrate an RPE65 mutation correction in a Leber congenital amaurosis 2 (LCA2) patient-specific iPSC line using enFnCas9 adenine base editor, highlighting its therapeutic utility.

Genome editing using the CRISPR Cas9 system has been used to manipulate eukaryotic DNA and make precise heritable changes. Although the widely used Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) and its engineered variants have been efficiently harnessed for numerous gene-editing applications across different platforms, concerns remain, regarding their putative off targeting at multiple loci across the genome. Here we report that Francisella novicida Cas9 (FnCas9) shows a very high specificity of binding to its intended targets and negligible binding to off-target loci. The specificity is determined by its minimal binding affinity with DNA when mismatches to the target sgRNA are present in the sgRNA:DNA heteroduplex. FnCas9 produces staggered cleavage, higher HDR rates and very low non-specific genome editing compared to SpCas9. We demonstrate FnCas9 mediated correction of the sickle cell mutation in patient derived iPSCs and propose that it can be used for precise therapeutic genome editing for a wide variety of genetic disorders.SIGNIFICANCE STATEMENT Therapeutic genome editing has been significantly accentuated by the advent of CRISPR based gene correction. However, genomic off-targeting has been a major setback for clinical translation. Although high fidelity versions of Cas9 have been rationally designed, they recognize and bind to off-targets. In this study, we characterize a naturally occurring Cas9 from Francisella novicida (FnCas9) that shows negligible binding affinity to off targets differing by one or more mismatches, rendering it highly specific in target recognition and editing. We show that FnCas9 can direct both HDR and NHEJ mediated DNA repair, generates higher rate of HDR and negligible off-target editing. Finally we show its potential in therapeutic genome editing by correcting the sickle cell anemia mutation in patient derived iPSCs.

Detection of pathogenic sequences or variants in DNA and RNA through a point-of-care diagnostic approach is valuable for rapid clinical prognosis. In recent times, CRISPR based detection of nucleic acids have provided an economical and quicker alternative to sequencing-based platforms which are often difficult to implement in the field. Here, we present FnCas9 Editor Linked Uniform Detection Assay (FELUDA) that employs a highly accurate enzymatic readout for detecting nucleotide sequences, identifying nucleobase identity and inferring zygosity with precision. We demonstrate that FELUDA output can be adapted to multiple signal detection platforms and can be quickly designed and deployed for versatile applications including rapid diagnosis during infectious disease outbreaks like COVID-19.### Competing Interest StatementD.C., S.M., M.A., R.P., A.S.A, D.S., N.S. and S.S. are authors in provisional patent applications that have been filed in relation to this work.

Locus-specific interrogation of the genome using programmable CRISPR-based technologies is tremendously useful in dissecting the molecular basis of target gene function and modulating its downstream output. Although these tools are widely utilized in recruiting genetically encoded functional proteins, display of small molecules using this technique is not well developed due to inadequate labeling technologies. Here, we report the development of a modular technology, sgRNA-Click (sgR-CLK), which harnesses the power of bioorthogonal click chemistry for remodeling CRISPR to display synthetic molecules on target genes. A terminal uridylyl transferase (TUTase) was repurposed to construct an sgRNA containing multiple minimally invasive bioorthogonal clickable handles, which served as a Trojan horse on CRISPR-dCas9 system to guide synthetic tags site-specifically on chromatin employing copper-catalyzed or strain-promoted click reactions. Our results demonstrate that sgR-CLK could provide a simplified solution for site-directed display of small molecules to study as well as modulate the function of gene targets.

Abstract Embryonic stem (ES) cells retain the ability to undergo lineage-specific differentiation that can eventually give rise to different cell types that constitute an organism. Although stem cell specific biological networks of transcription factors and epigenetic modifiers are well established, how the ES cell specific transcriptional and alternative splicing (AS) machinery regulate their expression has not been sufficiently explored. In this study, we show that the lncRNA associated protein TOBF1 regulates the co-transcriptional alternative splicing of transcripts necessary for maintaining stem cell identity in mouse ES cells. Overlaying information derived from TOBF1 chromatin occupancy, the distribution of its pluripotency-associated OCT-SOX binding motifs, and transcripts undergoing differential expression and alternative splicing upon its disruption unmasked local nuclear territories where these distinct events converge, ultimately leading to the maintenance of mouse ES cell identity.