Abstract Potassium ions (K + ) play a critical role as an essential electrolyte in all biological systems. Here we report the crystal structure-guided optimization and directed evolution of an improved genetically encoded fluorescent K + biosensor, GINKO2. GINKO2 is highly sensitive and specific for K + and enables in vivo detection of K + dynamics in multiple species.

Abstract The fine control of synaptic function requires robust trans-synaptic molecular interactions. However, it remains poorly understood how the landscape of trans-synaptic bridges dynamically remodels to reflect functional states of the synapse. Here we developed novel optical tools to visualize in firing synapses the molecular behavior of a particular secreted trans-synaptic protein, LGI1, and its presynaptic receptor, ADAM23, and discovered that neuronal activity acutely rearranges the abundance of these proteins at the synaptic cleft. Surprisingly, LGI1 in synapses was not secreted, as described elsewhere, but exo- and endocytosed through its interaction with ADAM23. Activity-driven translocation of LGI1 facilitated the formation of trans-synaptic connections proportionally to the history of activity of the synapse, adjusting excitatory transmission to synaptic firing rates. Thus, our findings reveal that LGI1 abundance at the synaptic cleft can be acutely remodeled and serves as a critical point of activity-dependent control of synaptic function. Highlights – Neuronal activity translocates LGI1 and ADAM23 to the presynaptic surface – LGI1 and ADAM23 are not located in synaptic vesicles – Stable cleft localization of LGI1 depends on the history of synaptic activity – LGI1 abundance at the synaptic cleft controls glutamate release

Abstract The distribution of synapses across dendritic arbors determines their contribution to neural computations since nonlinear conductances amplify co-active clustered inputs. To determine whether, and how patterned synaptic topography arises during development we developed a random-access microscope capable of full-neuron calcium imaging of activity and structural plasticity of developing neurons in awake Xenopus tadpoles. By imaging growing brain neurons in response to plasticity-inducing visual training, we show coordinated growth and synaptogenesis specific to each neuron’s spike tuning. High evoked activity in neurons tuned to the trained stimulus induced pruning of non-driven inputs across the dendritic arbor as these neurons strengthened their responses to this stimulus. In stark contrast, initially unresponsive neurons that shifted their spike tuning toward the trained stimulus exhibited localized growth and new responsive synapses near existing active inputs. These information-driven growth rules promote clustering of synapses tuned to a developing neuron’s emerging receptive field. One-Sentence Summary Sensory input directs brain neuronal growth and connectivity promoting clustering of synaptic inputs tuned to a neuron’s encoding properties.

Abstract To enable investigations of the emerging roles of cell-to-cell shuttling of L-lactate, we have developed an intensiometric green fluorescent genetically encoded biosensor for extracellular L-lactate. We demonstrate that this biosensor, designated eLACCO1.1, enables minimally invasive cellular resolution imaging of extracellular L-lactate in cultured mammalian cells and brain tissue.

Abstract l -Lactate is increasingly appreciated as a key metabolite and signaling molecule in mammals. To enable investigations of both the inter- and intra-cellular dynamics of l -Lactate, we develop a second-generation green fluorescent extracellular l -Lactate biosensor, designated eLACCO2.1, and a red fluorescent intracellular l -Lactate biosensor, designated R-iLACCO1. Compared to the first-generation eLACCO1.1 (Δ F / F = 1.5 in cultured neurons), eLACCO2.1 exhibits better membrane localization and fluorescence response (Δ F / F = 8.1 in cultured neurons) with faster response kinetics to extracellular l -Lactate on the surface of live mammalian cells. R-iLACCO1 and its affinity variants exhibit large fluorescence responses to changes in l -Lactate concentration in vitro (Δ F / F = 15 to 22) and in live mammalian cells (Δ F / F = 5.5 to 11). We demonstrate that these biosensors enable cellular-resolution imaging of extracellular and intracellular l -Lactate in cultured mammalian cells.

Intercellular communication mediated by a large number of neuromodulators diversifies physiological actions, yet neuromodulation remains poorly understood despite the recent upsurge of genetically encoded transmitter sensors. Here, we report the development of a versatile genetically encoded sensor-based image analysis program (GESIAP) that utilizes MATLAB-based algorithms to achieve high-throughput, high-resolution processing of sensor-based functional imaging data. GESIAP enables delineation of fundamental properties (e.g., transmitter spatial diffusion extent, quantal size, quantal content, release probability, pool size, and refilling rate at single release sites) of transmission mediated by various transmitters (i.e., monoamines, acetylcholine, neuropeptides, and glutamate) at various cell types (i.e., neurons, astrocytes, and other non-neuronal cells) of various animal species (i.e., mouse, rat, and human). Our analysis appraises a dozen of newly developed transmitter sensors, validates a conserved model of restricted non-volume neuromodulatory synaptic transmission, and accentuates a broad spectrum of presynaptic release properties that variegate neuromodulation.

Two-photon imaging and optogenetic stimulation rely on high illumination powers, particularly for state-of-the-art applications that target deeper structures, achieve faster measurements, or probe larger brain areas. However, little information is available on heating and resulting damage induced by high-power illumination in the brain. Here we used thermocouple probes and quantum dot nanothermometers to measure temperature changes induced by two-photon microscopy in the neocortex of awake and anaesthetized mice. We characterized heating as a function of wavelength, exposure time, and distance from the center of illumination. Although total power is highest near the surface of the brain, heating was most severe hundreds of microns below the focal plane, due to heat dissipation through the cranial window. Continuous illumination of a 1mm2 area produced a peak temperature increase of approximately 1.8°C/100mW. Continuous illumination with powers above 250 mW induced lasting damage, detected with immunohistochemistry against Iba1, GFAP, heat shock proteins, and activated Caspase-3. Higher powers were usable in experiments with limited duty ratios, suggesting an approach to mitigate damage in high-power microscopy experiments.

Current techniques for monitoring GABA, the primary inhibitory neurotransmitter in vertebrates, cannot follow ephemeral transients in intact neural circuits. We applied the design principles used to create iGluSnFR, a fluorescent reporter of synaptic glutamate, to develop a GABA sensor using a protein derived from a previously unsequenced Pseudomonas fluorescens strain. Structure-guided mutagenesis and library screening led to a usable iGABASnFR (maximum DeltaF/F ~ 2.5, Kd ~ 9 micromolar, good specificity, adequate kinetics). iGABASnFR is genetically encoded, detects single action potential-evoked GABA release events in culture, and produces readily detectable fluorescence increases in vivo in mice and zebrafish. iGABASnFR enabled tracking of: (1) mitochondrial GABA content and its modulation by an anticonvulsant; (2) swimming-evoked GABAergic transmission in zebrafish cerebellum; (3) GABA release events during inter-ictal spikes and seizures in awake mice; and (4) GABAergic tone decreases during isoflurane anesthesia. iGABASnFR will permit high spatiotemporal resolution of GABA signaling in intact preparations.

Voltage imaging enables monitoring neural activity at sub-millisecond and sub-compartment scale, and therefore opens the path to studying sub-threshold activity, synchrony, and network dynamics with unprecedented spatio-temporal resolution. However, high data rates ($>$800MB/s) and low signal-to-noise ratios have created a severe bottleneck for analysis of such datasets. Here we present VolPy, the first turn-key, automated and scalable pipeline to pre-process voltage imaging datasets. VolPy features fast motion correction, memory mapping, segmentation, and spike inference, all built on a highly parallelized and computationally efficient framework that optimizes memory and speed. Given the lack of single cell voltage imaging ground truth examples, we introduce a corpus of 24 manually annotated datasets from different preparations and voltage indicators. We benchmark VolPy against this corpus and electrophysiology recordings, demonstrating excellent performance in neuron localization, spike extraction, and scalability.

Point-scanning two-photon microscopy enables high-resolution imaging within scattering specimens such as the mammalian brain, but sequential acquisition of voxels fundamentally limits imaging speed. We developed a two-photon imaging technique that scans lines of excitation across a focal plane at multiple angles and uses prior information to recover high-resolution images at over 1.4 billion voxels per second. Using a structural image as a prior for recording neural activity, we imaged visually-evoked and spontaneous glutamate release across hundreds of dendritic spines in mice at depths over 250 microns and frame-rates over 1 kHz. Dendritic glutamate transients in anaesthetized mice are synchronized within spatially-contiguous domains spanning tens of microns at frequencies ranging from 1-100 Hz. We demonstrate high-speed recording of acetylcholine and calcium sensors, 3D single-particle tracking, and imaging in densely-labeled cortex. Our method surpasses limits on the speed of raster-scanned imaging imposed by fluorescence lifetime.