Summary The capacity to generate functional hepatocytes from renewable human pluripotent stem cells (hPSCs) could address limited supplies of primary human hepatocytes. However, hepatocytes differentiated from hPSCs in vitro are functionally immature. To understand mechanisms regulating maturation of in vitro derived hepatocytes, we developed a 3D spheroid differentiation system and compared gene regulatory elements in uncultured human primary hepatocytes with those in hepatocytes that were differentiated in 2D or 3D conditions from human PSCs by RNA-seq, ATAC-seq, and H3K27Ac ChIP-seq. Three-dimensional differentiation improved enhancer activity and expression of transcription factor ONECUT1 , but was insufficient to upregulate human-specific mature hepatocytes marker gene CYP3A4 or super-enhancer regulated transcription factor gene NFIC . Regulome comparisons showed reduced enrichment of thyroid receptor THRB motifs in accessible chromatin and in active enhancers without reduced transcription of THRB , suggesting the regulation at the level of THRB ligands in PSC-differentiated hepatocytes. Addition of thyroid hormone T3 to the PSC-differentiated hepatocytes increased CYP3A4 expression. T3 increased binding of THRB to the CYP3A4 proximal enhancer and restored the super-enhancer status and gene expression of NFIC and reduced expression of AFP . The resultant hPSC-hepatocytes showed gene expression, epigenetic status and super-enhancer landscape closer to primary hepatocytes and activated regulatory regions including non-coding SNPs associated with liver-related diseases. Transplanting the 3D PSC-hepatocytes into immunocompromised mice resulted in engraftment of human hepatocytes in the mouse liver parenchyma without disrupting normal liver histology at 6 months after transplantation. This work provides insights into the functions of nuclear receptor THRB and highlights the importance of the environmental factors-nuclear receptors axis in regulating maturation of human PSC-differentiated cell types.

Prolonged SARS-CoV-2 RNA shedding and recurrence of PCR-positive tests have been widely reported in patients after recovery, yet these patients most commonly are non-infectious. Here we investigated the possibility that SARS-CoV-2 RNAs can be reverse-transcribed and integrated into the human genome and that transcription of the integrated sequences might account for PCR-positive tests. In support of this hypothesis, we found chimeric transcripts consisting of viral fused to cellular sequences in published data sets of SARS-CoV-2 infected cultured cells and primary cells of patients, consistent with the transcription of viral sequences integrated into the genome. To experimentally corroborate the possibility of viral retro-integration, we describe evidence that SARS-CoV-2 RNAs can be reverse transcribed in human cells by reverse transcriptase (RT) from LINE-1 elements or by HIV-1 RT, and that these DNA sequences can be integrated into the cell genome and subsequently be transcribed. Human endogenous LINE-1 expression was induced upon SARS-CoV-2 infection or by cytokine exposure in cultured cells, suggesting a molecular mechanism for SARS-CoV-2 retro-integration in patients. This novel feature of SARS-CoV-2 infection may explain why patients can continue to produce viral RNA after recovery and suggests a new aspect of RNA virus replication.

Neuroblastoma (NB), derived from the neural crest (NC), is the most common pediatric extracranial solid tumor. Here we establish a platform that allows studying human NBs in mouse-human NC chimeras. Chimeric mice were produced by injecting human NC cells carrying NB relevant oncogenes in-utero into gastrulating mouse embryos. The mice developed tumors composed of a heterogenous cell population that closely resembled that seen in primary NBs of patients but were significantly different from homogenous tumors formed in xenotransplantation models. The human tumors emerged in immunocompetent hosts and were extensively infiltrated by mouse cytotoxic T cells reflecting a vigorous host anti-tumor immune response. However, the tumors blunted the immune response by inducing infiltration of regulatory T cells and expression of immune checkpoints similar to escape mechanisms seen in human cancer patients. Thus, this experimental platform allows studying human tumor initiation, progression, manifestation and tumor - immune-system interactions in an animal model system.