Close-up view of the nuclear periphery Cell biologists would like to be able to visualize complexes inside cells at molecular resolution. Several limitations, however, have prevented the field from realizing this goal. The thickness of most cells precludes cryo-electron tomography, a technique which itself does not provide sufficient contrast. Mahamid et al. successfully combined recent advances on both fronts to analyze structures in situ at the periphery of the nucleus. Their images reveal features that inform our understanding of the native organization of nuclear pores and of the nuclear lamina. Science , this issue p. 969

Summary

 Macromolecular crowding has a profound impact on reaction rates and the physical properties of the cell interior, but the mechanisms that regulate crowding are poorly understood. We developed genetically encoded multimeric nanoparticles (GEMs) to dissect these mechanisms. GEMs are homomultimeric scaffolds fused to a fluorescent protein that self-assemble into bright, stable particles of defined size and shape. By combining tracking of GEMs with genetic and pharmacological approaches, we discovered that the mTORC1 pathway can modulate the effective diffusion coefficient of particles ≥20 nm in diameter more than 2-fold by tuning ribosome concentration, without any discernable effect on the motion of molecules ≤5 nm. This change in ribosome concentration affected phase separation both in vitro and in vivo. Together, these results establish a role for mTORC1 in controlling both the mesoscale biophysical properties of the cytoplasm and biomolecular condensation.

Cryo-electron tomography (CET) is a three-dimensional imaging technique for structural studies of macromolecules under close-to-native conditions. In-depth analysis of macromolecule populations depicted in tomograms requires identification of subtomograms corresponding to putative particles, averaging of subtomograms to enhance their signal, and classification to capture the structural variations among them. Here, we introduce the open-source platform PyTom that unifies standard tomogram processing steps in a python toolbox. For subtomogram averaging, we implemented an adaptive adjustment of scoring and sampling that clearly improves the resolution of averages compared to static strategies. Furthermore, we present a novel stochastic classification method that yields significantly more accurate classification results than two deterministic approaches in simulations. We demonstrate that the PyTom workflow yields faithful results for alignment and classification of simulated and experimental subtomograms of ribosomes and GroEL14/GroEL14GroES7, respectively, as well as for the analysis of ribosomal 60S subunits in yeast cell lysate. PyTom enables parallelized processing of large numbers of tomograms, but also provides a convenient, sustainable environment for algorithmic development.

Summary Ribosomes are among the most abundant and complex machineries in the cell, however, the turnover of their subunits remains poorly understood. Here, we apply proteomic flux and cryo-electron microscopy analyses to interrogate the ribosome life cycle in human cells. We show that subpopulations of ribosomal subunits coexist, which vary in turnover kinetics and structure. Specifically, 80S ribosomes have a much longer half-life than free 40S and 60S ribosomal subunits, indicating that they represent distinct subunit pools that poorly intermix. Translation inhibition starkly increases the pool-size of 80S ribosomes in a translationally idle state and induces ribophagy of old ribosomes, ultimately rejuvenating the ribosome fleet. Our findings provide a comprehensive model for ribosome turnover and its regulation via translational activity.

Abstract Mitochondria are the powerhouse of eukaryotic cells. They possess their own gene expression machineries where highly divergent and specialized ribosomes, named hereafter mitoribosomes, translate the few essential messenger RNAs still encoded by mitochondrial genomes. Here, we present a biochemical and structural characterization of the mitoribosome in the model green alga Chlamydomonas reinhardtii , as well as a functional study of some of its specific components. Single particle cryo-electron microscopy resolves how the Chlamydomonas mitoribosome is assembled from 13 rRNA fragments encoded by separate non-contiguous gene pieces. Novel proteins, mainly helical repeat proteins, including OPR, PPR and mTERF proteins are found in Chlamydomonas mitoribosome, revealing the first structure of an OPR protein in complex with its RNA target. Targeted amiRNA silencing indicated that the novel ribosomal proteins are required for mitoribosome integrity. Finally, we use cryo-electron tomography to show that Chlamydomonas mitoribosomes are attached to the mitochondrial inner membrane via two contact points mediated by Chlamydomonas-specific proteins. Our study expands our understanding of the mitoribosome diversity and the various strategies they adopt for membrane tethering. Highlights * Structure of the Chlamydomonas reinhardtii mitoribosome * Fragmented ribosomal RNAs are stabilized by highly intertwined interactions with Chlamydomonas-specific proteins * Specific r-proteins are essential for rRNA homeostasis and respiratory fitness * Cryo-ET reveals the mitoribosome association to the inner mitochondrial membrane

Ergonomic assessment of manual work processes is important to prevent workplace injuries. Virtual reality simulations can be used to carry out an evaluation of work equipment and workplaces very early on. In combination with motion tracking analyses, data on posture during task performance and product use can then be collected. However, not all work situations can be equally represented in a virtual simulation. In particular, the virtual analysis of load handling poses a challenge in simulation, as body posture changes under the influence of external load weights. The aim is to increase immersion to bring the body movements in the virtual simulation closer to those in the real simulation with weights.For building up VR simulations with different aspects of visual, auditory and haptic immersion a scheme called immersion cube is presented. In order to be able to simulate load handling in VR, the immersion cube is used to investigate how much haptic immersion is needed to obtain sufficiently good data for the body movements measured in a VR setting. The first study showed that the deviation between real and virtual executions depends heavily on the task (lifting from the ground, move while standing, lifting over the shoulder). In some tasks, virtual and real simulation are very close to one another for certain body movements and could therefore in principle be used for ergonomic assessment. On the other hand there are still movements that vary between these two forms of execution and therefore show a need for increasing the immersion.

With faithful sample preservation and direct imaging of fully hydrated biological material, cryo-electron tomography (cryo-ET) provides an accurate representation of molecular architecture of cells. However, detection and precise localization of macromolecular complexes within cellular environments is aggravated by the presence of many molecular species and molecular crowding. We developed a template-free image processing procedure for accurate tracing of complex networks of densities in cryo-electron tomograms, a comprehensive and automated detection of heterogeneous membrane-bound complexes and an unsupervised classification. Applying this procedure to tomograms of intact cells and isolated endoplasmic reticulum (ER), we detected and classified small protein complexes like the ER protein translocons, which were not detected by other methods before. This classification provided sufficiently homogeneous particle sets and initial references to allow subsequent de novo subtomogram averaging. Therefore the procedure presented allows a comprehensive detection and a structural analysis of complexes in their native state. In addition, we present structural evidence that different ribosome-free translocon species are present at the ER membrane, determine their 3D structure, and show that they have different localization patterns forming nanodomains.

Macromolecular crowding has a profound impact on reaction rates and the physical properties of the cell interior, but the mechanisms that regulate crowding are poorly understood. We developed Genetically Encoded Multimeric nanoparticles (GEMs) to dissect these mechanisms. GEMs are homomultimeric scaffolds fused to a fluorescent protein. GEMs self-assemble into bright, stable fluorescent particles of defined size and shape. By combining tracking of GEMs with genetic and pharmacological approaches, we discovered that the mTORC1 pathway can tune the effective diffusion coefficient of macromolecules ≥15 nm in diameter more than 2-fold without any discernable effect on the motion of molecules ≤5 nm. These mTORC1-dependent changes in crowding and rheology affect phase-separation both in vitro and in vivo. Together, these results establish a role for mTORC1 in controlling both the biophysical properties of the cytoplasm and the phase-separation of biopolymers.

Abstract Cellular functionality relies on a well-balanced, but highly dynamic proteome. Dysfunction of mitochondrial protein import leads to the cytosolic accumulation of mitochondrial precursor proteins which compromise cellular proteostasis and trigger the mitoprotein-induced stress response. To dissect the effects of mitochondrial dysfunction on the cellular proteome as a whole, we developed pre-post thermal proteome profiling (ppTPP). This multiplexed time-resolved proteome-wide thermal stability profiling approach with isobaric peptide tags in combination with a pulsed SILAC labeling elucidated dynamic proteostasis changes in several dimensions: In addition to adaptations in protein abundance, we observed rapid modulations of the thermal stability of individual cellular proteins. Strikingly, different functional groups of proteins showed characteristic response patterns and reacted with group-specific kinetics, allowing the identification of the functional modules that are relevant for mitoprotein-induced stress. Thus, our new ppTPP approach uncovered a complex response network that orchestrates proteome homeostasis in eukaryotic cells by time-controlled adaptations of protein abundance and protein stability.