Conventional reprogramming methods rely on the ectopic expression of transcription factors to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs). The forced expression of transcription factors may lead to off-target gene activation and heterogeneous reprogramming, resulting in the emergence of alternative cell types and aberrant iPSCs. Activation of endogenous pluripotency factors by CRISPR activation (CRISPRa) can reduce this heterogeneity. Here, we describe a high-efficiency reprogramming of human somatic cells into iPSCs using optimized CRISPRa. Efficient reprogramming was dependent on the additional targeting of the embryo genome activation-enriched Alu-motif and the miR-302/367 locus. Single-cell transcriptome analysis revealed that the optimized CRISPRa reprogrammed cells more directly and specifically into the pluripotent state when compared to the conventional reprogramming method. These findings support the use of CRISPRa for high-quality pluripotent reprogramming of human cells.

Abstract CRISPR/Cas9 based gene activation (CRISPRa) is an attractive tool for cellular reprogramming applications due to its high multiplexing capacity and direct targeting of endogenous loci. Here we present the reprogramming of primary human skin fibroblasts into induced pluripotent stem cells (iPSC) using CRISPRa, targeting endogenous OCT4 , SOX2 , KLF4 , MYC and LIN28A promoters. The basal reprogramming efficiency can be improved by an order of magnitude by additionally targeting a conserved Alu-motif, enriched near genes involved in embryo genome activation (EEA-motif). This effect is mediated in part by more efficient activation of NANOG and REX1 . These data constitute a proof of principle that somatic cells can be reprogrammed into iPSC using only CRISPRa. Furthermore, the results unravel previously uncharacterized involvement of EEA-motif-associated mechanisms in cellular reprogramming.

Abstract DUX4 has recently been recognized as a key regulator in human embryonic genome activation (EGA). The exact role of DUX4 in human embryo is still elusive, partly due to the cytotoxicity of persistent DUX4 expression in cellular models. We report here that a transient DUX4 expression in human embryonic stem cells (hESCs) retains cell viability while inducing an EGA-like expression program in a subpopulation of the cells. These cells showed resemblance to 8-cell stage blastomeres and were thus named induced blastomere-like (iBM) cells. Trajectory inference from the single-cell RNA-seq data suggested that the expression profile of these cells progressed in a manner similar to the morula to blastocyst transition in human embryo. Finally, viable iBM cells could be enriched using an antibody against NaPi2b (SLC34A2), paving the way for further experimental approaches. The iBM cells can become a powerful tool to model transcriptional dynamics and regulation during early human embryogenesis.

Abstract With the advancement of human stem cell cultures and interest in understanding human embryogenesis, human blastocyst-like structures, or human blastoids, are being developed. Thus far, two different strategies have been taken, generating blastoids from naïve human pluripotent stem cells (hPSC) 1–3 or through reprogramming of adult human somatic cells 4 . All these studies utilize comparative transcriptome analyses to authenticate blastoid cells and identify their counterparts in the human blastocyst 5,6 . However, the validity of comparative transcriptome analysis is critically hinged on including relevant reference data, not only those from targeted cell types but also from potential alternative cell lineages. Thus, we sought to reevaluate the single-cell transcriptome data from the blastoids based on a more comprehensive cellular reference, which includes data from in vitro cultured human 6,7 , non-human primate (NHP, Cynomolgus macaque ) blastocysts 8 , a human stem cell-based post-implantation amniotic sac embryoid (PASE) model 9 , and an in vivo gastrulation-stage human embryo specimen 10 , using four different analysis strategies. Our analyses unequivocally support that blastoids developed by reprogramming adult human somatic cells largely fail to generate cells with a transcriptome profile consistent with the human blastocyst trophectoderm. Instead, cells identified as trophectoderm-like have a transcriptional profile more similar to the amniotic ectoderm in the gastrulating human and NHP embryos. To facilitate cell lineage identifications in human embryo models, we further identified a set of human amniotic ectoderm and trophectoderm markers that could be utilized to distinguish these two lineages. We further built a neural-network based online prediction tool, which accurately discerns the full cellular composition of blastoids.