Macrophage activation and persistent inflammation contribute to the pathological process of spinal cord injury (SCI). It was reported that M2 macrophages were induced at 3-7 days after SCI but M2 markers were reduced or eliminated after 1 week. By contrast, M1 macrophage response is rapidly induced and then maintained at injured spinal cord. However, factors that modulate macrophage phenotype and function are poorly understood. We developed a model to distinguish bone-marrow derived macrophages (BMDMs) from residential microglia and explored how BMDMs change their phenotype and functions in response to the lesion-related factors in injured spinal cord. Infiltrating BMDMs expressing higher Mac-2 and lower CX3CR1 migrate to the epicenter of injury, while microglia expressing lower Mac-2 but higher CX3CR1 distribute to the edges of lesion. Myelin debris at the lesion site switches BMDMs from M2 phenotype towards M1-like phenotype. Myelin debris activates ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) for cholesterol efflux in response to myelin debris loading in vitro. However, this homeostatic mechanism in injured site is overwhelmed, leading to the development of foamy macrophages and lipid plaque in the lesion site. The persistence of these cells indicates a pro-inflammatory environment, associated with enhanced neurotoxicity and impaired wound healing. These foamy macrophages have poor capacity to phagocytose apoptotic neutrophils resulting in uningested neutrophils releasing their toxic contents and further tissue damage. In conclusion, these data demonstrate for the first time that myelin debris generated in injured spinal cord modulates macrophage activation. Lipid accumulation following macrophage phenotype switch contributes to SCI pathology.

Abstract Current technologies for acquiring spatial transcript information from tissue sections rely on either RNA probes or spatial barcodes. The former methods require a priori knowledge for probeset formulation; the latter have yet to achieve single cell resolution and/or transcript capture efficiencies approaching dissociative, single-cell methods. Here, we describe a novel spatial transcriptome assay called p olony (or DNA cluster)- i nde xe d l ibrary-sequencing (PIXEL-seq). It improves upon other spatial barcoding methods by employing “continuous” polony oligos arrayed across a customized gel surface. In terms of assay performance, PIXEL-seq attains ≤ 1 µm resolution and captures >1,000 unique molecular identifiers/10×10 µm 2 . In other words, this global, naive platform achieves subcellular spatial transcriptome mapping while maintaining high transcript capture efficiencies.

Abstract As the primary source of norepinephrine (NE) in the brain, the locus coeruleus (LC) regulates both arousal and stress responses 1,2 . However, how local neuromodulatory inputs contribute to LC function remains unresolved. Here we identify a network of transcriptionally and functionally diverse GABAergic neurons in the LC dendritic field that integrate distant inputs and modulate modes of LC firing to control arousal. We define peri-LC anatomy using viral tracing and combine single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics to molecularly define both LC and peri-LC cell types. We identify several cell types which underlie peri-LC functional diversity using a series of complementary approaches in behaving mice. Our findings indicate that LC and peri-LC neurons comprise transcriptionally and functionally heterogenous neuronal populations, alongside anatomically segregated features which coordinate specific influences on behavioral arousal and avoidance states. Defining the molecular, cellular and functional diversity in the LC provides a road map for understanding the neurobiological basis of arousal alongside hyperarousal-related neuropsychiatric phenotypes.

Cell surface glycosylation patterns are markers of cell type and status. However, the mechanisms regulating surface glycosylation patterns remain unknown. Using a panel of carbohydrate markers, we have shown that cell surface sialylation and fucosylation are upregulated in L1-transfected embryonic stem cells (L1-ESCs). Consistently, the mRNA levels of sialyltransferase ST6Gal1 and ST3Gal4, and fucosyltransferase FUT9 were significantly increased in L1-transfected ESCs. Activation of L1 signaling promoted cell survival and inhibited cell proliferation. ShRNAs knocking down FUT9, ST6Gal1 and ST3Gal4 blocked these effects. A phospholipase Cgamma (PLCgamma) inhibitor and shRNA reduced ST6Gal1, ST3Gal4 and FUT9 mRNA levels in the L1-ESCs. Thus, embryonic stem cell surface sialylation and fucosylation are regulated via PLCgamma by L1, with which they cooperate to modulate cell survival and proliferation.

ABSTRACT In the intestine, luminal sampling by microfold (M) cells is crucial for inducing protective mucosal immune responses but can also serve as an entry pathway for pathogens, including bacteria and viruses. Enteric pathogens can influence intestinal M cell function; however, the molecular mechanisms involved in the regulation of uptake and transcytosis of gut cargo by human M cells remain to be determined. Understanding the mechanisms responsible for regulating human M cell function requires a relevant human model. In this study, human ileal enteroids established from healthy donors were grown as confluent monolayers on permeable supports and differentiated to express mature M cells. Enteric pathogens including enteropathogenic E. coli (EPEC), adherent invasive E. coli (AIEC), and human rotavirus were apically exposed to M cell enteroid monolayers. M cell-mediated uptake and transcytosis was compared in enteroids infected by pathogenic or commensal bacteria (HS strain). EPEC and AIEC, but not HS, stimulated M cell uptake and transcytosis. We discovered that this pathogenspecific effect was dependent on expression of coronin 1a, a cytoskeletal remodeling protein. Using stable coronin 1a knockdown (KD) enteroids, we observed that EPEC-stimulated transcytosis of fluorescent beads was lost and associated with a significant decrease in the number of glycoprotein-2 positive (Gp-2 +ve ) M cells. The results of these studies demonstrate that coronin 1a is required for uptake and transcytosis of luminal cargo across human M cells and that coronin 1a is necessary for differentiation of mature M cells that actively transcytose luminal gut antigens in response to pathogenic, but not commensal, microbes.

ABSTRACT Extracellular vesicles (EVs) are membrane-encapsulated structures released by cells which carry signaling factors, proteins and microRNAs that mediate intercellular communication. Accumulating evidence supports an important role of EVs in the progression of neurological conditions and both the spread and pathogenesis of infectious diseases. It has recently been demonstrated that EVs from Hepatitis C virus (HCV) infected individuals and cells contained replicative-competent viral RNA that was capable of infecting hepatocytes. Being a member of the same viral family, it is likely the Zika virus also hijacks EV pathways to package viral components and secrete vesicles that are infectious and potentially less immunogenic. As EVs have been shown to cross blood-brain and placental barriers, it is possible that Zika virus could usurp normal EV biology to gain access to the brain or developing fetus. Here, we demonstrate that Zika virus infected cells secrete distinct EV sub-populations with specific viral protein profiles and infectious genomes. Zika virus infection resulted in the enhanced production of EVs with varying sizes and density compared to those released from non-infected cells. We also show that the EV enriched tetraspanin CD63 regulates the release of EVs, and Zika viral genomes and capsids following infection. Overall, these findings provide evidence for an alternative means of Zika virus transmission and demonstrate the role of EV biogenesis and trafficking proteins in the modulation of Zika infection. Importance Zika virus is a re-emerging infectious disease that spread rapidly across the Caribbean and South America. Infection of pregnant women during the first trimester has been linked to microcephaly, a neurological condition where babies are born with smaller heads due to abnormal brain development. Babies born with microcephaly can develop convulsions and suffer disabilities as they age. Despite the significance of Zika virus, little is known about how the virus infects the fetus or causes disease. Extracellular vesicles (EVs) are membrane-encapsulated structures released by cells that are present in all biological fluids. EVs carry signaling factors, proteins and microRNAs that mediate intercellular communication. EVs have been shown to be a means by which some viruses can alter cellular environments and cross previously unpassable cellular barriers. Thus gaining a greater understanding of how Zika affects EV cargo may aid in the development of better diagnostics, targeted therapeutics and prophylactic treatments.

Abstract Current extracellular vesicle (EV) isolation methods depend on large expensive equipment like ultracentrifuges and are laborious and time consuming. There is also currently no method available for high throughput isolation to meet clinical demands. Here, we present a method that combines our previous published ExtraPEG method and magnetic beads. Western blot and nanoparticle tracking analysis (NTA) of the purified EVs revealed higher or equivalent recovery and purity with this method compared to ExtraPEG or size exclusion chromatography (SEC) methods. With this newly developed workflow and automated liquid handling instrument, we have successfully isolated up to 96 EV samples from 5 µL pre-cleared serum in 45 minutes. Moreover, DNA / small RNA / protein purification and profiling steps could be seamlessly integrated into the isolation workflow. To profile EV protein markers, EVs were lysed from the binding step and covalently bound to the surface of the beads. TotalSeq or ELISA antibody can be applied with under a standard protocol. With this extended protocol, researchers can easily complete EV isolation and protein profiling experiment within 8 hours. Taken together, we provide a high throughput method for EV isolation and molecular analyses that may be used for sensitive biomarker detection from biological fluids.

Abstract Recently, therapies utilizing extracellular vesicles (EVs) derived from mesenchymal stromal/stem cells (MSCs) have begun to show promise in clinical trials. However, EV therapeutic potential varies with MSC tissue source and in vitro expansion through passaging. To find the optimal MSC source for clinically translatable EV‐derived therapies, this study aims to compare the angiogenic and immunomodulatory potentials and the protein and miRNA cargo compositions of EVs isolated from the two most common clinical sources of adult MSCs, bone marrow and adipose tissue, across different passage numbers. Primary bone marrow‐derived MSCs (BMSCs) and adipose‐derived MSCs (ASCs) were isolated from adult female Lewis rats and expanded in vitro to the indicated passage numbers (P2, P4, and P8). EVs were isolated from the culture medium of P2, P4, and P8 BMSCs and ASCs and characterized for EV size, number, surface markers, protein content, and morphology. EVs isolated from different tissue sources showed different EV yields per cell, EV sizes, and protein yield per EV. Gene ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway analyses of proteomics data and miRNA seq data identified key proteins and pathways associated with differences between BMSC‐EVs and ASC‐EVs, as well as differences due to passage number. In vitro tube formation assays employing human umbilical vein endothelial cells suggested that both tissue source and passage number had significant effects on the angiogenic capacity of EVs. With or without lipopolysaccharide (LPS) stimulation, EVs more significantly impacted expression of M2‐macrophage genes (IL‐10, Arg1, TGFβ) than M1‐macrophage genes (IL‐6, NOS2, TNFα). By correlating the proteomics analyses with the miRNA seq analysis and differences observed in our in vitro immunomodulatory, angiogenic, and proliferation assays, this study highlights the trade‐offs that may be necessary in selecting the optimal MSC source for development of clinical EV therapies.

Abstract The cytokine granulocyte-macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) possesses the ability to differentiate macrophages (MØs) with opposing functions, namely proinflammatory M1-like and immunosuppressive M2-like. Despite the importance and opposing functional outcomes of these processes, the intrinsic mechanism that regulates the functional polarization of MØs under GM-CSF signaling remains elusive. Here we show that GM-CSF induced MØs polarisation resulted in the expression of the Cytokine-inducible SH2-containing protein (CIS), and that CIS deficiency diverted differentiation of monocytes into immunosuppressive M2-like MØs expression. CIS deficiency resulted in the hyperactivation of the JAK-STAT5 signaling pathway, consequently promoting the downregulation of the transcription factor Interferon Regulatory Factor 8 (IRF8). Loss and gain of function approaches highlighted IRF8 as a critical instructor of the M1-like polarisation program. In vivo, CIS deficiency led to skewing to M2-like macrophages, which induced strong Th2 immune responses characterised by the development of severe experimental asthma. Collectively, we reveal a CIS-censored mechanism interpreting the opposing actions of GM-CSF in MØ differentiation and uncovering its role in controlling allergic inflammation.

Abstract Sterile alpha motif and histidine-aspartic acid domain containing protein-1 (SAMHD1) is a deoxynucleoside triphosphate (dNTP) triphosphohydrolase central to cellular nucleotide pool homeostasis. Recent literature has also demonstrated how SAMHD1 can detoxify chemotherapy metabolites thereby controlling their clinical responses. To further understand SAMHD1 biology and to investigate the potential of targeting this enzyme as a neoadjuvant to existing chemotherapies we set out to discover selective small molecule-based inhibitors of SAMHD1. Here we report a discovery pipeline encompassing a biochemical screening campaign and a set of complementary biochemical, biophysical, and cell-based readouts for further characterisation of the screen output. The identified hit compound TH6342 and its analogues, accompanied by their inactive negative control analogue TH7126, demonstrated specific, low μM potency in inhibiting the hydrolysis of both natural substrates and nucleotide analogue therapeutics, shown using complementary enzyme-coupled and direct enzymatic activity assays. Their mode of inhibition was subsequently detailed by coupling kinetic studies with thermal shift assays, where TH6342 and analogues were shown to engage with pre-tetrameric SAMHD1 and deter the oligomerisation and allosteric activation of SAMHD1 without occupying nucleotide binding pockets. We further outline the development and application of multiple cellular assays for assessing cellular target engagement and associated functional effects, including CETSA and an in-cell dNTP hydrolase activity assay, which highlighted future optimisation strategies of this chemotype. In summary, with a novel mode of inhibition, TH6342 and analogues broaden the set of tool compounds available in deciphering SAMHD1 enzymology and functions, and furthermore, the discovery pipeline reported herein represents a thorough framework for future SAMHD1 inhibitor development. Abstract Figure